一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法技术

一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，将含有糖基化蛋白的非糖基化蛋白样品或含有非糖基化蛋白的糖基化蛋白样品采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离，该分离所用的缓冲液中含有Ba2+，Ba2+在缓冲液中的浓度至少为5mM。本发明专利技术可用于胰岛素及其类似物的纯化，可显著提高纯化效率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】，将含有糖基化蛋白的非糖基化蛋白样品或含有非糖基化蛋白的糖基化蛋白样品采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离，该分离所用的缓冲液中含有Ba2+，Ba2+在缓冲液中的浓度至少为5mM。本专利技术可用于胰岛素及其类似物的纯化，可显著提高纯化效率。【专利说明】
本专利技术涉及糖基化蛋白或前体与非糖基化蛋白或前体的色谱分离方法。
技术介绍
在蛋白质生产过程中，糖基化蛋白及前体和非糖基化蛋白及前体的分离是一个独特的研究领域。在去除糖基化杂质或者非糖基化杂质时往往会遇到比较大的困难。蛋白或蛋白前体可以表达自酵母或者CHO、NSO或者昆虫细胞等真核细胞表达系统。特别是在酵母中，随着表达量的增高，糖基化的蛋白亦会较高的表达。这样就需要有较好的方法来进行非糖基化蛋白中糖基化蛋白的去除。在酵母表达系统中，目的蛋白可以表达在胞内或者分泌到胞外，通过构建不同的载体，以得到不同的目的蛋白或前体；在哺乳细胞表达系统中，蛋白亦可以通过不同的表达载体进行胞内或者胞外表达。在前期的纯化中，需要进行蛋白质的初纯，主要利用多种色谱层析介质进行，如酵母细胞表达蛋白利用离子交换层析进行捕获及利用盐离子梯度或者PH进行洗脱，或者利用亲和标签的亲和层析。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行糖基化和非糖基化蛋白的分离，层析缓冲液可以包括有机溶剂和其它常用的盐离子如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等。但是现有技术中，各种盐的加入对蛋白的分离影响，除了 US6180757专利中所提到的Ca2+的添加外，对其它二价阳离子在这方面的应用上没有提及。例如，在现有的胰岛素及其类似物的纯化工艺中，糖基化的杂质去除主要靠RP-HPLC及缓冲液中Ca2+的添加，这虽然能有效去除糖基化蛋白，但是其上样量仍然不高，分离纯化效率仍有待于进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供，通过添加特定的离子，实现样品中糖基化蛋白和非糖基化蛋白的高效分离的目标。以下对本专利技术进行一般性的描述。蛋白或蛋白前体及类似物主要来自于酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统及昆虫细胞表达系统。在蛋白质药物的生产过程中，色谱层析应用广泛。在表达或者后期的改造过程中，蛋白往往会发生一系列的修饰，一系列的色谱层析及其它纯化步骤也被广泛应用，比如疏水层析、反相高效液相层析、离子交换、亲和层析、(NH4)2SO4沉淀、PI沉淀、结晶等。本专利技术主要应用在糖基化蛋白和非糖基化蛋白的柱层析步骤。在糖基化和非糖基化蛋白的分离纯化中，缓冲液中至少含有5mM的Ba2+，从而达到糖基化和非糖基化蛋白的有效分离。色谱层析进行蛋白质分离的基本原则是在一定的流动相缓冲液中不同结构的蛋白质和固定相的层析介质的相互作用不同，采用不同的流动相和固定相，蛋白质在层析柱上的保留时间不同，从而达到不同种类或者不同结构蛋白质的有效分离。色谱层析可以选用多种不同性质的层析介质和层析方法，最好选用反相高效液相色谱(RP-HPLC)层析。在样品的选择上，蛋白样品至少应该含有一定量的糖基化蛋白，其可以是单糖基化、二糖基化或者多糖基化或者它们的混合物。和不含Ba2+缓冲液进行糖基化与非糖基化蛋白的分离相比较，含有Ba2+，其至少可以增加60%的上样量，同时亦显著增加目的蛋白的纯度。与含有Ca2+的缓冲液比较，其也可以在相同的纯度及得率下提高10% -40%的上样量，或者在同样的上样量下大大提高目的蛋白的纯度。蛋白纯度也和层析介质基质材料及孔径及颗粒大小有关。不同大小的蛋白需要不同孔径的介质与其相匹配，胰岛素或者胰岛素类似物孔径应该为120-200A，层析蛋白上样量可以达到250-350mg/cm2 (柱长250_300mm)。层析柱温可以4-35 °C，最好是20-35 V，温度低于最佳范围，其分离效率会大大降低。利用本专利技术可以比不加Ba2+的工艺显著地提高产率，其产物中目的蛋白纯度亦显著提高，利用Ba2+则可以在使用较低的离子浓度的情况下比US6180757所述的Ca2+有更高的效率，同样上样量的情况下有更高的纯度，同样纯度要求下可以增加10% -40%的上样量，这样就可以大大提高胰岛素及其类似物的纯化效率，其可以在后续步骤添加SO/—来进行Ba2+的有效去除或者通过缓冲液置换予以去除。应用本方法，既可以获得非糖基化的蛋白，亦可纯化获得糖基化蛋白，两种形式都可以显著提高效率。在分离糖基化与非糖基化蛋白方面，本专利技术具有特别的优势，若是在非糖基化蛋白中去除糖基化的杂质，如进行胰岛素类蛋白的纯化，其糖基化的胰岛素类蛋白可以去除至0.15%以下，甚至0.1%以下。这可以使样品中糖基化蛋白的浓度降低20倍以上。如果在样品中也加入Ba2+,其分尚效率 会更进一步提闻。 利用本专利技术分离的样品，可以是任何含有糖基化的非糖基化蛋白，或者是含有非糖基化的糖基化蛋白。这些蛋白可以来自于酵母表达系统，亦可以是哺乳动物细胞表达系统，如CH0、NS0表达系统，亦可以是昆虫细胞表达系统或者原核表达系统。这些样品可以直接亦可以经过几步初纯后应用本方法进行分离。Ba2+的加入，其在分离糖基化和非糖基化蛋白方面所起的作用胜于任何常见一价阳离子的加入所起的作用，这些一价阳离子可以是Na+、NH4+、K+、Li+等单独或者混合。这些结果说明Ba2+具有一价离子所没有的特性，其可以显著改变糖基化和非糖基化蛋白的疏水差异性。三价阳离子亦可能具有相似的性质，只是三价阳离子如Fe3+在一般的溶液中比较容易沉淀，应用起来不方便。Ba2+的提供可以应用其盐酸盐、硝酸盐、醋酸盐等，只要能稳定可溶于缓冲液中即可。Ba2+的应用亦可以联合应用一价阳离子盐，其一价阳离子的加入的浓度和Ba2+加入的浓度具有交互影响作用，Ba2+的浓度达到5-10mM已经足以达到分离效果，亦可以多加直至达到溶解度，一价阳离子的浓度可以是100-400mM，最好是200_300mM，其加入量一般是Ba2+的10-50倍以上。在各种一价阳离子联合应用的选择上，Na+、NH4+、K+、Li+等浓度具有相似性。可以单独使用亦可以联合应用。进行分离时，一般pH越高越好，可以选择6-8.5，在不影响层析介质寿命和蛋白活性的情况下选择偏高的PH，比如应用到7-8。进行糖基化蛋白的分离，其可以利用等梯度洗脱亦可以进行梯度洗脱，一般情况进行5-15CV的柱保留可以进行较好的分离。利用RP-HPLC进行层析分离，可以包含任何有机溶剂，其可以是乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇等。在本专利技术中所述实例中有机溶剂的浓度占30% -40%体积。利用本专利技术可以进行胰岛素类蛋白的纯化，其可以有效去除糖基化的胰岛素或其类似物，得到纯度较高的非糖基化胰岛素或其类似物。利用本专利技术，可以使胰岛素类蛋白中的糖基化蛋白浓度降低到0.15%以下，一般可以降低到0.1%以下。在纯化非糖基化蛋白方面，特别是胰岛素及其类似物的纯化方面，可以具有广泛的应用，例如在医药方面胰岛素对糖尿病的治疗，在生物制药方面培养基中胰岛素及其相关促生长因子的添加等，应用十分广泛。在糖蛋白的分离上，本专利技术中所涉及的蛋白为所有的糖基化蛋白及其前体，尤其是胰岛素及其类似物或者前体蛋白。另一点需要明确指出的是在胰岛素及其类似物类蛋白上，所收集的是不含糖基化的目的蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：将含有糖基化蛋白的非糖基化蛋白样品或含有非糖基化蛋白的糖基化蛋白样品采用反相高效液相色谱进行分离，该分离所用的缓冲液中含有Ba2+，Ba2+在缓冲液中的浓度至少为5mM。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾娜娜，郭怀祖，
申请(专利权)人：郭怀祖，
类型：发明
国别省市：