糖基化的IL-7，制备及应用制造技术

本发明专利技术的发明专利技术名称为“糖基化的IL-7，制备及应用”，属于生物制药领域，更具体来说属于白介素-7变体的药物应用领域。本发明专利技术涉及新的和改进的白介素-7多肽，以及含有它们的组合物、它们的制剂和应用。更具体来说，本发明专利技术涉及了具有改进的性质的超糖基化的IL-7多肽，以及它们的生产和治疗性应用。本发明专利技术还公开了具有修饰的氨基酸序列、含有人工产生的糖基化位点的新的IL-7多肽，以及相应的核酸分子、载体和重组宿主细胞。本发明专利技术还涉及了使用这样的多肽、细胞或核酸，用于治疗性或预防性治疗哺乳动物受试者，包括人类受试者。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2006年7月19日、申请号为200680026503.X、发明名称为“糖基化的IL-7，制备及应用”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术涉及新的改进的白介素-7多肽，以及含有它的组合物及其制备和应用。更具体来说，本专利技术涉及具有改进的性质的超糖基化的IL-7多肽，以及它们的生产和治疗应用。本专利技术还公开了新的具有修饰的含有人工产生的糖基化位点的氨基酸序列的IL-7多肽，以及相应的核酸分子、载体和重组宿主或宿主细胞。本专利技术还涉及了使用这样的多肽、细胞或核酸用来治愈性或预防性治疗哺乳动物受试者，包括人类受试者。专利技术背景B和T淋巴细胞是免疫反应的主要效应细胞。这两类细胞被认为最终都是从哺乳动物骨髓中的造血干细胞通过代表每种类别细胞的分化过程中不同的阶段的祖细胞或前体细胞衍生而来的。成熟的T细胞主要在胸腺中发育，可能是由在T淋巴细胞发育的早期从骨髓迁移到胸腺的前体细胞发育而来的。淋巴样细胞的发育依赖于各种基质细胞产生的生长、存活和分化因子。有大量因子对成熟的外周B和T细胞有活性，包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、γ-干扰素、BSF-2、神经白细胞素、转化生长因子β和IL-7。“白介素-7”或“IL-7”是指哺乳动物内源分泌的糖蛋白，能够诱导骨髓衍生的淋巴细胞祖细胞和前体细胞、包括被称为前B细胞的特化的前体细胞的增殖。尽管最初是从骨髓细胞株的基质成分衍生而来的，>但IL-7也被胸腺基质细胞、肠和其它上皮细胞、某些树突状细胞和滤泡树突状细胞、角质细胞和基本上所有的淋巴样组织所分泌。这种蛋白的另一种命名是“前B细胞生长因子”和“淋巴细胞生成素-1”。EP0314415(或US4,965,195)描述了哺乳动物白介素-7蛋白和相应的DNAs。人类IL-7的氨基酸序列包含三个推测的N-连接的糖基化位点，位于70、91和116位的Asn残基上。hIL-7(人类IL-7)在COS细胞中的瞬时重组表达使得r-huIL-7(重组人类IL-7)可以被观察到为表观分子量大约为20、24和28kDa的三个蛋白条带(Cosman等，LymphokineReceptorInteractions；1989；179:229-236)。hIL-7在BHK细胞中的稳定重组表达也已经被报道(Armitage等；TheJournalofImmunology；1990；144:938-941)。但是，天然存在的人类IL-7的糖基化状态、特别是O-糖基化状态还从来没有被记录或研究过，并且糖基化情况对IL-7性质的影响也从来没有被考虑过。此外，正如在EP0314415中描述的那样，在大肠杆菌中产生的未糖基化的成熟的人类IL-7(r-hIL-7)，表现出17,387道尔顿的分子量，在体外在基于各种淋巴细胞种群的增殖的特定的生物分析中显示出高的活性。其它的细胞因子和生长因子例如G-CSF、GM-CSF、IFN、HGF等，没有糖基化时也表现出完整的治疗活性。WO2004/018681公开了人类IL-7的一种活性构象异构体，包含了下列二硫桥：1-4(C2-C92)、2-5(C34-C129)和3-6(C47-C141)，并公开了生产方法或研究其特征的方法及其应用。IL-7最初是作为细胞因子被公开的，其主要活性是诱导前体B细胞的增殖(NamenA.E.等；JournalofExperimentalmedicine；1988；167:988-1002)。最近已经报道IL-7在T细胞发育的早期阶段参与了胸腺细胞(T-细胞)的存活和增殖(SchlunsK.S.等；NatureImmunology；2000；1(5):426-432)。IL-7途径对于淋巴细胞发育、特别是发育为胸腺细胞是重要的(MaeurerM.J.等；Int.Rev.Immunol.；1998；16:309-22-FryT.J.等；Blood；2002；99:3892-904)。Fry及合作者还鉴定出IL-7在多因子作用中作为不依赖胸腺的T-细胞再生的潜在调节剂((FryT.J.等.；Blood；2001；97(6):1525-1533)。IL-7有力地调节成熟的T细胞，并且除了对成熟T-细胞的这种效应之外，IL-7还可以影响抗原呈递细胞的发育(MarquezC.等；J.Exp.Med.；1995；181:475-83)。IL-7对于CD4+和CD8+亚类的记忆T细胞的再生也是重要的(KondrackR.M.等；J.Exp.Med.；2003；198:1797-806-KaechS.M.等；Nat.Immunol.；2003；4:1191-8)。因此，IL-7具有极大的治疗潜力，可以用于刺激T细胞前体、分泌抗体的B细胞的增殖，用于刺激抗原驱动的T-细胞外周扩增，用于生产幼稚T细胞以及其它造血细胞类型。活性IL-7分子的一种特别有趣的治疗应用是用于淋巴细胞减少的病人的免疫重建，这样的病人包括癌症治疗病人、接受骨髓或干细胞移植的病人、表现出获得性或遗传免疫缺陷的病人、老年病人或任何具有低CD4计数的病人。由于IL-7具有产生新的幼稚CD4T-细胞以及扩增特定的库以产生或增加特异性免疫反应(疫苗增强)的能力，它在这些方面还有其它的应用。鉴于其治疗潜力，对于开发适合于有效的治疗应用的生物活性或改进的IL-7多肽有相当大的兴趣。就这点而言，在可以商业获得的各种细胞因子和生长因子中，有些是低免疫原性的(例如α-干扰素“IFNα”，粒细胞集落刺激因子“G-CSF”)，以便相应的药物物质不需要超过通常接受的重组蛋白常规水平的非常特定的多肽纯度。相反，其它的生长因子具有更高的免疫原性(例如β-干扰素“β-IFN”，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子“GM-CSF”)，或它们比活性对于生命来说非常重要(例如红细胞生成素，“EPO”)，以至于药物物质多肽的纯度和分布情况必须被特别地研究并维持在狭窄的限度内，以保护免受免疫原性的影响。IL-7是独特的分子。由于其内在的免疫增强性质，用作治疗药剂的IL-7特别易于触发抗IL-7的免疫原性(抗IL-7的结合或中和抗体)。这种免疫原性对于蛋白的长期治疗活性是有害的。抗IL-7抗体可以修饰IL-7的药物动力学，并中和其治疗活性。有多种IL-7同工型参与触发抗IL-7的免疫原性，其中包括：改变的多肽序列(例如氧化、还原、脱酰胺基的或截短的形式)、共价的或非共价的IL-7多聚体、例如聚集的IL-7分子等。因此，本文档来自技高网...

【技术保护点】
纯化的哺乳动物超糖基化IL‑7多肽，其中该超糖基化的IL‑7多肽含有至少3个N‑糖基化氨基酸残基。

【技术特征摘要】
2005.07.20 EP 05291556.81.纯化的哺乳动物超糖基化IL-7多肽，其中该超糖基化的IL-7多肽含有至少3个N-糖基化氨基酸残基。
2.超糖基化的IL-7组合物，其中该组合物含有至少80％的在至少3个不同的氨基酸残基上被N-糖基化的IL-7多肽。
3.权利要求2中的组合物，其中该组合物含有80％到95％之间的在至少3个不同的氨基酸残基上被N-糖基化的IL-7多肽。
4.权利要求2或3中的超糖基化的IL-7组合物，含有至少80％的IL-7多肽，该多肽在3个到最多达8个不同的氨基酸残基上被糖基化、包括1个O-和最多达7个N-糖基化位点。
5.权利要求4中的组合物，其中该组合物含有80％到95％之间的IL-7多肽，该多肽在3个到最多达8个不同的氨基酸残基上被糖基化、包括1个O-和最多达7个N-糖基化位点。
6.权利要求2到5任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中的IL-7多肽是人类IL-7多肽。
7.权利要求2到6任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中的糖基化位点是在IL-7多肽序列中天然存在和/或人工产生的。
8.权利要求2到7任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中的IL-7多肽是人类IL-7多肽，以及其中的糖基化位点选自70、91和116位的Asn残基，110位的Thr，以及表1中和优选在表2中列出的任何人工产生的糖基化位点，或其组合。
9.权利要求2到7任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中该IL-7多肽含有或富集选自下面的N-连接的糖链：
a)哺乳动物类型的糖链，优选为CHO细胞表达的类型；
b)含有复杂的N-糖链(例如三天线或二天线结构)、更优选含有大量甘露糖和乙酰葡萄糖胺分子和大量末端唾液酸残基的糖链；
c)被α-2,6-唾液酸转移酶或α-2,3-唾液酸转移酶唾液酸化的糖链；和/或
d)显示出3到30个、优选7到23个唾液酸基-N-乙酰半乳糖胺的唾液酸化的糖链。
10.权利要求9中的超糖基化的IL-7组合物，其中该IL-7多肽还含有或还富集具有末端唾液酸残基的O-连接的糖链。
11.权利要求9中的超糖基化的IL-7组合物，其中的糖链含有带有部分或完全末端唾液酸化的四天线到二天线结构，更优选含有三或二唾液酸化的三天线结构，和/或带有二唾液酸化的二天线结构。
12.权利要求2到11任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中该IL-7多肽的平均等电点低于6.5，用质谱分析确定的平均表观分子量大于25KDa，或用SDS凝胶电泳确定的平均分子量大于27Kda。
13.权利要求2到12任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中该IL-7超糖基化多肽显示在哺乳动物宿主中延长的体内半衰期和平均存留时间。
14.具有修饰的氨基酸序列的IL-7多肽，其中该序列含有至少1个人工产生的糖基化位点。
15.权利要求14中的多肽，其中该多肽含有1、2、3或4个，更优选1、2或3个，甚至更优选1或2个人工产生的糖基化位点。
16.权利要求14或15中的多肽，其中该多肽含有的人类IL-7多肽的序列含有选自下面的一个或几个氨基酸修饰：Lys28Asn-Ile30Ser-Ile30Thr-Ile30Asn-Ser32Thr-Leu35Ser-Leu35Thr-Glu38Ser-Glu38Thr-Phe39Ser-Phe39Thr-Phe42Ser-Ph...

【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔·莫雷尔，布里吉特·阿苏利纳，依安娜·朗塞，安娜·格雷瓜尔，科里纳·布雷克，
申请(专利权)人：叙塞理斯，
类型：发明
国别省市：法国;FR