本发明专利技术公开了一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法，采用的连接肽基因序列来源于牛弹性蛋白基序，从中选择常用的限制性内切酶Kpn I。p40引物的下游5′末端含有连接肽基因并具有Kpn I酶切位点，而p35引物的上游5′末端含有连接肽基因并具有Kpn I酶切位点。这样p35、p40两个亚基基因PCR产物经Kpn I酶切后产生互补的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，p35、p40两个亚基基因通过连接肽基因易连接。连接产物通过p40上游引物与p35下游引物进行PCR得以扩增。本发明专利技术是是一种简单、方便有效的利用连接肽基因将两个亚基基因相连的分子克隆方法。
【技术实现步骤摘要】
—种猪白细胞介素12两个亚基基因P35和P40拼接的新方法
本专利技术属于生物
，涉及一种猪白细胞介素12两个亚基基因P35和P40拼接的新方法。
技术介绍
白细胞介素12(interleukin-12，IL-12)，又称自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF)，它具有众多的生物学功能，在机体抗感染和抗肿瘤过程中发挥着重要作用。IL-12蛋白是由P35及P40两个亚基通过二硫键交连而成。两个亚基必须同时在细胞内表达才能产生有完整生物学活性的IL-12。所以，在进行猪IL-12的体外表达、生物学功能研究以及进行基因治疗时，如何使两个亚基基因表达比例适当，广生具有完整生物学活性的蛋白是非常重要的。在IL-12基因研究过程中，常将两个亚基基因由某一肽段基因相连，形成一条肽链，表达产物自行相连，形成IL-12蛋白，这样实现人IL-12两个亚基基因在细胞内以相同的比例同步共表达，完全保证两个亚基的有效连接，使基因转录以及翻译水平的表达在体内顺畅进行，保证IL-12蛋白三维结构的正确折叠等翻译后的修饰加工。 研究者采用多种分子克隆技术将两个亚基利用连接肽基因进行有效地拼接，如将p35、p40基因及连接肽基因用一定的酶切，逐一连于表达载体。这一方法原理比较简单，但过程繁琐、耗时。利用聚合酶链反应(cpolymerase chainreact1n, PCR)重叠延伸的方法将p35、p40基因及连接肽基因连接在一起。虽然过程简单，但反应条件需要摸索，同时，由于重叠PCR反应的复杂性，使其特异性较差，为后续克隆挑选带来一定的难度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法，是一种简单、方便有效的利用连接肽基因将两个亚基基因相连的分子克隆方法，采用的连接肽基因序列来源于牛弹性蛋白基序，被Invivogen公司证明是有效的连接P35、p40两个亚基基因的连接肽。利用分子生物学软件对设计的拼接基因全序列进行分析，发现在连接肽基因序列存在整个序列的多个单一酶切位点，从中选择常用的限制性内切酶Kpn LP40引物的下游5'末端含有连接肽基因并具有Kpn I酶切位点，而P35引物的上游5'末端含有连接肽基因并具有Kpn I酶切位点。这样p35、p40两个亚基基因PCR产物经Kp η I酶切后产生互补的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，ρ35、Ρ40两个亚基基因通过连接肽基因易连接。连接产物通过ρ40上游引物与ρ35下游引物进行PCR得以扩增。其具体技术方案为: 一种猪白细胞介素12两个亚基基因ρ35和ρ40拼接的新方法，包括以下步骤: (1)ρ40和ρ35基因片段的获得 根据GenBank上的ρ40、ρ35基因序列，设计引物由上海生工公司合成，ρ40引物:上游引物:5' -AAA TA TGCGGCCGCTAA GCCACCA T-GGGTCAC-3'，在 5'端引入 N ot I 酶切位点，下游引物:5' -GGCAGGTACCCCTACTCCA GGAAC-CATTCGCTCCAA GA TGA GCT-3'，在 5 '引入 Kp η I 酶切位点；ρ35 引物:上游引物:5 ^ -A TC2CGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCC-CCGTGGCCA-3' ,5'端引入 Kpn I 酶切位点，下游引物:5' -CCGCTCGA GCGTTAGGAA GCA T-TCA GA TA GS1 ,5'端引入X ho I酶切位点，在p40下游引物和p35下游引物引入两个亚基基因连接的连接肽基因，为GTTCCTGGA GTA GGGG-TACCTGGGGTGGGC，内部含有Kpn I酶切位点，分别以质粒P ED (EMC-3) -p40、p ED (EMC-3) -p35为模板，应用TaqDNA聚合酶及上述引物扩增p40、p35基因片段，p40基因片段PCR反应条件为:95°C预变性5min，94°C变性lmin，58°C退火45s，72°C延伸lmin，共30个循环，末次循环后72°C延伸lOmin, p35基因片段PCR反应条件为95°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火45s，72°C延伸45s，共30个循环，末次循环后72°C延伸lOmin，PCR产物通过I %琼脂糖凝胶电泳予以鉴定； (2) p40和p35基因片段拼接 PCR产物利用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，用Kpn I酶切纯化的p40、p35基因PCR产物，酶切片段用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，应用T4DNA连接酶对纯化的酶切片段进行连接，以连接产物为模板，应用Taq DNA聚合酶、p40上游引物和p35下游引物进行连接产物的PCR扩增，PCR反应条件为95°C预变性5min，94°C变性lmin，58°C退火45s，72°C延伸lmin30s，共30个循环，末次循环后72°C延伸lOmin，PCR产物通过I %琼脂糖凝胶电泳予以鉴定； (3)p40、p35基因片段拼接产物的克隆与鉴定 连接产物的PCR产物利用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，得到的目的拼接片段应用Kpn I酶切鉴定，目的拼接片段与pMD18-Tvector进行连接，并转化大肠杆菌JM109，37°C培养24h，经蓝白筛选，随机挑取白色菌落，扩菌后应用质粒小量快速提取试剂盒按说明提取质粒，以NOt I和X ho I双酶切，37°C水浴2h，，通过1%琼脂糖凝胶电泳予以鉴定，酶切鉴定正确后再送交上海生工测序中心进行测序鉴定。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果为:本专利技术只利用一步酶切、一步连接、两步PCR就完成了 p35、p40两基因的拼接。通过克隆与测序分析，表明p35、p40两基因片段成功地被拼接在一起。该方法既简化了逐一连接基因片段的多步克隆筛选的烦琐过程，同时又避免了 PCR重叠延伸方法的复杂性及特异性较差的缺点。所以该方法简便、快速，同时具有特异性，是一种非常有效的利用连接肽基因进行P35、p40两基因连接的方法。该方法所提供的基因拼接策略不仅仅用于本研究而且可以用于其他需要多个基因拼接的研究。 【附图说明】 图1为p35和p40基因PCR产物的I %琼脂糖凝胶电泳图； 图2为pMD18-1L-12双酶切产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。 【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。 I材料与方法 1.1实验材料 质粒pED (EMC-3)-p40 和 pED (EMC-3)-p35 由兰文升博士不不惠赠；pMD182Tvector和限制性内切酶Kpn 1、X ho 1、N ot I购自大连宝生物公司；凝胶回收试剂盒购自维杭州特洁公司；质粒小量快速提取试剂盒购自北京博大泰克公司；Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、dN TP购自MBI公司JM109菌株是常规工具菌株，为青岛农业大学动物科技学院微生物实验室保存。 1.2 p40、p35基因片段的获得根据GenBank上的p40、p35基因序列，设计引物(由上海生工公司合成)。P40引物:上游引本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)p40和p35基因片段的获得根据GenBank上的p40、p35基因序列，设计引物由上海生工公司合成，p40引物：上游引物：5′‑AAA TA TGCGGCCGCTAA GCCACCA T‑GGGTCAC‑3′，在5′端引入N ot I酶切位点，下游引物：5′‑GGCAGGTACCCCTACTCCA GGAAC‑CATTCGCTCCAA GA TGA GCT‑3′，在5′引入Kp n I酶切位点；p35引物：上游引物：5′‑A TC2CGGTACCTGGGGTGGGCGCCA GAAACCTCC‑CCGTGGCCA‑3′，5′端引入Kp n I酶切位点，下游引物：5′‑CCGCTCGA GCGTTA GGAA GCA T‑TCA GA TA G‑3′，5′端引入X ho I酶切位点，在p40下游引物和p35下游引物引入两个亚基基因连接的连接肽基因，为GTTCCTGGA GTA GGGG‑TACCTGGGGTGGGC，内部含有Kp n I酶切位点，分别以质粒p ED(EMC‑3)‑p40、p ED(EMC‑3)‑p35为模板，应用Taq DNA聚合酶及上述引物扩增p40、p35基因片段，p40基因片段PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，末次循环后72℃延伸10min，p35基因片段PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，末次循环后72℃延伸10min，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳予以鉴定；(2)p40和p35基因片段拼接PCR产物利用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，用Kpn I酶切纯化的p40、p35基因PCR产物，酶切片段用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，应用T4DNA连接酶对纯化的酶切片段进行连接，以连接产物为模板，应用Taq DNA聚合酶、p40上游引物和p35下游引物进行连接产物的PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min30s，共30个循环，末次循环后72℃延伸10min，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳予以鉴定；(3)p40、p35基因片段拼接产物的克隆与鉴定连接产物的PCR产物利用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，得到的目的拼接片段应用Kpn I酶切鉴定，目的拼接片段与pMD18‑Tvector进行连接，并转化大肠杆菌JM109，经37℃培养24h，蓝白筛选，随机挑取白色菌落，扩菌后应用质粒小量快速提取试剂盒按说明提取质粒，以N ot I和Xho I双酶切，37℃水浴2h，通过1％琼脂糖凝胶电泳予以鉴定，酶切鉴定正确后再送交上海生工测序中心进行测序鉴定。...
【技术特征摘要】
1.一种猪白细胞介素12两个亚基基因P35和P40拼接的新方法，其特征在于， 包括以下步骤: (1)ρ40和p35基因片段的获得 根据GenBank上的p40、p35基因序列，设计引物由上海生工公司合成，p40引物:上游引物:5' -AAA TA TGCGGCCGCTAA GCCACCA T-GGGTCAC-3'，在 5'端引入 N ot I 酶切位点，下游引物:5' -GGCAGGTACCCCTACTCCA GGAAC-CATTCGCTCCAA GA TGA GCT-3'，在 5 '引入 Kp η I 酶切位点；ρ35 引物:上游引物:5 ^ -A TC2CGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCC-CCGTGGCCA-3' ,5'端引入 Kp η I 酶切位点，下游引物:5' -CCGCTCGA GCGTTAGGAA GCA T-TCA GA TA GS1 ,5'端引入X ho I酶切位点，在p40下游引物和p35下游引物引入两个亚基基因连接的连接肽基因，为GTTCCTGGA GTA GGGG-TACCTGGGGTGGGC，内部含有Kp η I酶切位点，分别以质粒P ED (EMC-3) -p40、p ED (EMC-3) -p35为模板，应用TaqDNA聚合酶及上述引物扩增p40、p35基因片段，p40基因片段PCR反应条件为:95°C预变性5min，94°C变性lmin，58°C退火45s，72°C延...
【专利技术属性】
技术研发人员：温建新，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。