一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法技术

本发明专利技术公开了一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法，采用的连接肽基因序列来源于牛弹性蛋白基序，从中选择常用的限制性内切酶Kpn I。p40引物的下游5′末端含有连接肽基因并具有Kpn I酶切位点，而p35引物的上游5′末端含有连接肽基因并具有Kpn I酶切位点。这样p35、p40两个亚基基因PCR产物经Kpn I酶切后产生互补的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，p35、p40两个亚基基因通过连接肽基因易连接。连接产物通过p40上游引物与p35下游引物进行PCR得以扩增。本发明专利技术是是一种简单、方便有效的利用连接肽基因将两个亚基基因相连的分子克隆方法。

【技术实现步骤摘要】
—种猪白细胞介素12两个亚基基因P35和P40拼接的新方法
本专利技术属于生物
，涉及一种猪白细胞介素12两个亚基基因P35和P40拼接的新方法。
技术介绍
白细胞介素12(interleukin-12，IL-12)，又称自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF)，它具有众多的生物学功能，在机体抗感染和抗肿瘤过程中发挥着重要作用。IL-12蛋白是由P35及P40两个亚基通过二硫键交连而成。两个亚基必须同时在细胞内表达才能产生有完整生物学活性的IL-12。所以，在进行猪IL-12的体外表达、生物学功能研究以及进行基因治疗时，如何使两个亚基基因表达比例适当，广生具有完整生物学活性的蛋白是非常重要的。在IL-12基因研究过程中，常将两个亚基基因由某一肽段基因相连，形成一条肽链，表达产物自行相连，形成IL-12蛋白，这样实现人IL-12两个亚基基因在细胞内以相同的比例同步共表达，完全保证两个亚基的有效连接，使基因转录以及翻译水平的表达在体内顺畅进行，保证IL-12蛋白三维结构的正确折叠等翻译后的修饰加工。 研究者采用多种分子克隆技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)p40和p35基因片段的获得根据GenBank上的p40、p35基因序列，设计引物由上海生工公司合成，p40引物：上游引物：5′‑AAA TA TGCGGCCGCTAA GCCACCA T‑GGGTCAC‑3′，在5′端引入N ot I酶切位点，下游引物：5′‑GGCAGGTACCCCTACTCCA GGAAC‑CATTCGCTCCAA GA TGA GCT‑3′，在5′引入Kp n I酶切位点；p35引物：上游引物：5′‑A TC2CGGTACCTGGGGTGGGCGCCA GAAACCTCC‑CCG...

【技术特征摘要】
1.一种猪白细胞介素12两个亚基基因P35和P40拼接的新方法，其特征在于， 包括以下步骤: (1)ρ40和p35基因片段的获得 根据GenBank上的p40、p35基因序列，设计引物由上海生工公司合成，p40引物:上游引物:5' -AAA TA TGCGGCCGCTAA GCCACCA T-GGGTCAC-3'，在 5'端引入 N ot I 酶切位点，下游引物:5' -GGCAGGTACCCCTACTCCA GGAAC-CATTCGCTCCAA GA TGA GCT-3'，在 5 '引入 Kp η I 酶切位点；ρ35 引物:上游引物:5 ^ -A TC2CGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCC-CCGTGGCCA-3' ,5'端引入 Kp η I 酶切位点，下游引物:5' -CCGCTCGA GCGTTAGGAA GCA T-TCA GA TA GS1 ,5'端引入X ho I酶切位点，在p40下游引物和p35下游引物引入两个亚基基因连接的连接肽基因，为GTTCCTGGA GTA GGGG-TACCTGGGGTGGGC，内部含有Kp η I酶切位点，分别以质粒P ED (EMC-3) -p40、p ED (EMC-3) -p35为模板，应用TaqDNA聚合酶及上述引物扩增p40、p35基因片段，p40基因片段PCR反应条件为:95°C预变性5min，94°C变性lmin，58°C退火45s，72°C延...

【专利技术属性】
技术研发人员：温建新，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37