一种细菌多糖结合疫苗的载体蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细菌多糖O糖基化修饰的重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白及其应用。本发明专利技术提供了一种多糖和蛋白的偶联物，由细菌多糖和重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白偶联而成；所述细菌多糖以O-糖苷键形式连接在所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白的糖基化位点上。实验发现，本发明专利技术细菌多糖O糖基化修饰的重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白用于细菌多糖蛋白结合疫苗的制备，可以提高诱导动物产生抗多糖抗体的能力，并可避免病原菌培养的诸多问题，提高疫苗的均一性以及生产效率，降低疫苗制备的成本，因此具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种细菌多糖O糖基化修饰的重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白及其应用，属于生物医药领域。
技术介绍
病原菌的O-多糖(O-PS)、荚膜多糖(CPS)等往往是其重要的保护性抗原，如大肠杆菌的O157型，霍乱弧菌的O1型、O139型，肺炎链球菌的4、6B、9V、14、18C、19F、23F等，金黄色葡萄球菌的CP5和CP8，等等。许多针对多糖的抗体为病原菌的中和抗体，因此多糖疫苗的研发一直是细菌疫苗研发的重点之一。但多糖疫苗的免疫记忆和免疫原性较弱，现在这类疫苗的研发重点已转向多糖-蛋白结合疫苗，例如，7价肺炎多糖-蛋白结合疫苗、4价脑膜炎结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗已经上市，同时，一批多糖-蛋白结合疫苗正处于不同的研发阶段。目前，多糖-蛋白结合疫苗采用化学法制备，为了解决蛋白与多糖之间的化学空间位阻效应，使多糖蛋白结合物有更好的免疫原性，制备时多采用连接臂连接蛋白与多糖。根据蛋白与多糖的结合方法，可采用胺还原反应、酰胺化反应、二硫键连接反应、异脲键连接反应、肟化学反应和重氮化学反应制备。不同的结合方式制备的多糖蛋白结合物的免疫原性也不同，甚至引起严重的副反应。具体的制备过程包括以下步骤：①大规模培养病原菌(或其疫苗株)，从中提取多糖；②制备并提纯白喉、破伤风等类毒素作为载体蛋白；③通过化学方法使多糖和载体蛋白随机交联；④再次纯化交联的多糖-蛋白结合物制备疫苗。该生产过程步骤多、得率低、成本高，存在生物安全性差、产物不均一、质控困难、易引发副反应等不足。近些年来，基于细菌糖基化修饰系统发展而来的生物交联技术有望改善化学合成法制备多糖-蛋白结合疫苗的缺陷。如今，在多种细菌中发现了天然的蛋白质糖基化修饰系统，如空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统、奈瑟球菌和绿脓杆菌的O-糖基化修饰系统，这些糖基化修饰系统中，多糖的合成途径与细菌的脂多糖和荚膜多糖的合成途径十分相似，且其寡糖转移酶对其转移的多糖专一性较低，这就使通过改造细菌糖基化修饰系统来制备细菌多糖修饰目的蛋白在理论上成为可能。空肠弯曲弧菌N-糖基化修饰系统中的寡糖转移酶PglB对多糖底物有一定的要求：多糖还原末端第一位糖基的C2位必须有乙酰氨基，且第二位糖基不能以β(1-4)糖苷键与其连接。而脑膜炎奈瑟球菌O-糖基化修饰系统中的寡糖转移酶PglL对多糖底物无类似的要求，PglL能将C2位无乙酰氨基的多糖转移至蛋白的糖基化位点上，因此具有更广泛的应用前景。化学合成法制备的多糖蛋白结合疫苗，其多糖与蛋白的连接方式多样，多糖与蛋白往往多点交联，形成网状结构，能大大提高多糖的免疫原性。生物交联技术制备的为天然糖蛋白，多糖与蛋白以N糖苷键或O糖苷键单末端结合，这样可以最大限度地暴露多糖的抗原表位，但是由于载体蛋白糖基化位点数量少，多糖蛋白比较低，限制了其免疫原性。为了解决此缺陷，一方面可通过在载体蛋白合适的位置添加糖基化位点的方法增加多糖蛋白比，以提高多糖的免疫原性，另一方面可通过使载体蛋白形成聚体或VLP样结构，从而增加免疫原性。霍乱毒素B亚单位(CTB)可通过非共价键结合形成稳定的桶形五聚体结构，其亚基间结合力很强，是目前已知最为稳定的非共价键结合蛋白复合体之一。CTB的受体为神经节苷脂GM1，GM1存在于体内几乎所有的细胞类型中，因此CTB可以作用于T细胞、B细胞或抗原提呈细胞，通过多种可能的机制直接激活免疫系统。天然CTB具有较强的佐剂活性，可以增强细菌、病毒以及其他抗原的免疫原性，尤其是经黏膜途径免疫，不仅可以增强血清特异性抗体应答，而且还可以诱导较强的特异性黏膜IgA免疫应答，增强机体抵抗病原微生物感染的能力。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种多糖和蛋白偶联物。本专利技术提供的多糖和蛋白偶联物，由细菌多糖和重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白偶联而成；所述细菌多糖以O-糖苷键形式连接在所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白的糖基化位点上；所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白包括霍乱毒素B亚单位和脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的截短体；所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的截短体为从氨基酸残基区段的C端起截去不同数量氨基酸残基后形成的多肽，且所述截短体含有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL识别的糖基化位点；所述氨基酸残基区段为PilE的第45至73位氨基酸残基形成的区段。上述偶联物中，所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE截短体为PilE的第45至73位氨基酸残基形成的多肽，且所述截短体含有一个脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL识别的糖基化位点，所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶识别的糖基化位点为PilE的第63位丝氨酸；所述PilE的氨基酸序列为序列表中序列33；所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4；所述细菌多糖可以是宿主细菌多糖，也可以是外源细菌多糖，本专利技术为大肠杆菌O157O多糖、痢疾杆菌O多糖或甲型副伤寒沙门氏菌O多糖。本专利技术的第二个目的是提供一种制备上述多糖和蛋白偶联物的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：培养表达O多糖合成基因簇、脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因和上述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白编码基因的重组菌，得到上述多糖和蛋白偶联物。上述方法中，所述重组菌按照方法A或方法B制备，所述方法A包括如下步骤：将所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因和上述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白编码基因导入含有O多糖合成基因簇宿主菌中，得到重组菌；所述方法B包括如下步骤：将外源O多糖合成基因簇、所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因和上述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白编码基因导入自身不含有O多糖合成基因簇的宿主菌中，得到重组菌；所述宿主菌为细菌；所述自身不含有O多糖合成基因簇的宿主菌为大肠杆菌；具体为大肠杆菌K12系列菌株；所述含有O多糖合成基因簇的宿主菌为福氏志贺氏菌或甲型副伤寒沙门氏菌。上述方法中，所述外源O多糖合成基因簇的核苷酸序列为序列表中序列30；所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶的氨基酸序列为序列32，或其具有类似功能的突变体；所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因的核苷酸序列具体为序列2第184-1998位；所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白的氨基酸序列为序列4，所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列3。上述方法中，所述方法A或方法B中，在所述导入的步骤前，还包括将所述宿主菌敲除基因组中的O-抗原连接酶编码基因的步骤。上述敲除采用Red重组的方法进行，具体见实施例。上述方法中，所述方法A包括如下步骤：去除所述福氏志贺氏菌的毒力大质粒pCP，且敲除其基因组中的O-抗原连接酶编码基因，再向所述福氏志贺氏菌中导入所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因和所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白编码基因，得到重组福氏志贺氏菌；详见实施例1；福氏志贺氏菌为S.flexneri2a301。所述方法A在本实施例中，上述去除所述福氏志贺氏菌的毒力大质粒pCP的方法：将带有inc片段的pKDinc重组质粒导入S.flexneri2a301中，使毒力大质粒丢失，得到S.flexneri2a301ΔpCP/pKDinc；再将S.flexneri2a301ΔpCP/pKDinc42℃连续培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多糖和蛋白偶联物，由细菌O多糖和重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白偶联而成；所述细菌多糖以O‑糖苷键形式连接在所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白的糖基化位点上；所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白包括霍乱毒素B亚单位和脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的截短体；所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的截短体为从氨基酸残基区段的C端起截去不同数量氨基酸残基后形成的多肽，且所述截短体含有脑膜炎奈瑟球菌O‑寡糖转移酶PglL识别的糖基化位点；所述氨基酸残基区段为至少包含PilE的第45至66位氨基酸残基形成的区段。

【技术特征摘要】
1.一种多糖和蛋白偶联物，由细菌O多糖和重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白偶联而成；所述细菌多糖以O-糖苷键形式连接在所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白的糖基化位点上；所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白包括霍乱毒素B亚单位和脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的截短体；所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的截短体为从氨基酸残基区段的C端起截去不同数量氨基酸残基后形成的多肽，且所述截短体含有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL识别的糖基化位点；所述氨基酸残基区段为至少包含PilE的第45至66位氨基酸残基形成的区段。2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于：所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE截短体为PilE的第45至73位氨基酸残基形成的多肽，且所述截短体含有一个脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL识别的糖基化位点，所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶识别的糖基化位点为PilE的第63位丝氨酸；所述PilE的氨基酸序列为序列表中序列33；所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4；所述细菌多糖为大肠杆菌O157O多糖、痢疾杆菌O多糖或甲型副伤寒沙门氏菌O多糖。3.一种制备权利要求1或2中任一所述多糖和蛋白偶联物的方法，包括如下步骤：培养表达O多糖合成基因簇、脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因和权利要求1或2中的所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白编码基因的重组菌，得到权利要求1或2中的所述多糖和蛋白偶联物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组菌按照方法A或方法B制备，所述方法A包括如下步骤：将所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因和权利要求1-3中的所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白编码基因导入含有O多糖合成基因簇宿主菌中，得到重组菌；所述方法B包括如下步骤：将外源O多糖合成基因簇、所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因和权利要求1-3中的所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白编码基因导入自身不含有O多糖合成基因簇的宿主菌中，得到重组菌；所述宿主菌为细菌；所述自身不含有O多糖合成基因簇的宿主菌为大肠杆菌；所述含有O多糖合成基因簇的宿主菌为福氏志贺氏菌或甲型副伤寒沙门氏菌。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶的氨基酸序列为序列32；所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶编码基因的核苷酸序列具体为序列2第184-1998...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴军，孙鹏，王恒樑，潘超，刘波，朱力，唱韶红，巩新，曾明，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11