本发明专利技术涉及一种用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，步骤如下：1）粗酶的制备：将菌体经高压破碎，离心得粗酶液；2）固定化酶的制备：将粗酶与预处理的纤维素于磷酸缓冲液中反应，使酶固定在纤维素表面，酶的量为2-15mg酶/g湿重纤维素；3）糖基化葛根素的制备：在搅拌条件下，将溶于反应介质中的葛根素与固定化酶进行转化反应，反应体系的ph为3.0-8.0，温度5-50℃，时间1-24小时；4）糖基化葛根素的纯化：将转化液经双柱串联层析分离，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥，制得糖基化葛根素；反应结束后，过滤回收固定化酶。本发明专利技术的优点为：成本低，转化副产物少，固定化酶可重复利用，适应于规模化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及糖基化葛根素的制备，具体地说是。
技术介绍
葛根素(puerarin),8-C- β -D-葡萄糖基-7，4' 二轻基-异黄酮(8-C- β -D-Glucopyranosyl-7, 4' -hydroxy-1soflavone)。葛根素毒性小、安全范围广、疗效好，具有广泛的 药理作用，临床上主要应用于心脑血管系统疾病、糖尿病、眼底疾病、突发性耳聋、急性酒精中毒、拟菊酯类农药中毒及肿瘤的治疗。但是临床使用中葛根素存在如下缺点(1)体内消除速率快，临床使用剂量较大，口服生物利用度低；(2)葛根素水溶解度低，仅为6. 24g/L，因此临床使用的注射剂中需加入助溶剂，以提高溶解度。因此对葛根素进行修饰改造，改善其水溶性和脂溶性，提高其生物利用度及选择性，最终增强其药理活性，是一种行之有效的开发新药途径，也是当前葛根素研究的热点。研究表明，氧化微杆菌(Microbacterium oxydans CGMCC 1788)通过静息细胞转化或细胞粗酶提取液转化，可以将葛根素转化为葛根素-7-0-葡萄糖苷。与葛根素相比，葛根素-7-0-葡萄糖苷水溶解度提高18倍，有较长的半衰期及平均滞留时间，能在血液中维持较高的血药浓度，舒张血管作用也略优于天然葛根素。同时，采用TritonX-100处理氧化微杆菌，破坏其细胞膜结构，增加细胞渗透性，可以将葛根素转化为葛根素-7-0-果糖苷。但是由于细胞膜的屏障作用，静息细胞转化积累产物耗费的时间较长，副产物较多；细胞反复回收利用，细胞逐渐自溶，转化活性降低，不利于规模化生产；细胞粗酶提取液在反应过程中极易受pH、温度等外界环境影响而变性失活；粗酶提取液不能回收再利用，也不易长期保存；酶纯化过程异常复杂繁琐，耗时长、得率低；因此细胞转化和细胞粗酶提取液转化效率低，周期长，不利于工业化生产。固定化酶将为工业化生产糖基化葛根素提供新技术。固定化酶是指固定在适合载体上并在一定空间范围内能连续进行催化反应的酶。固定化酶不仅保持了酶的催化特性，而且克服了游离酶的不足，具有增加酶的稳定性，酶可反复或连续使用以及酶和反应产物易于分离的优点，因而效率高、成本低。自从20世纪60年代日本首次固定化氨基酰化酶工业化连续生产L-氨基酸以来，固定化酶技术为酶的工业化运用开辟了广阔的发展空间。但至今，固定化酶在生产糖基化葛根素方面的应用尚未见相关专利和报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酶可以回收并重复利用的用固定化酶转化葛根素生产糖基化葛根素的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为用固定化酶生产糖基化葛根素包括如下操作步骤(I)粗酶液的制备将氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans CGMCC 1788)培养至 OD6tltlL O—3. O,离心收集菌体，加预冷PH8. O的磷酸缓冲液重悬，破碎两次，离心得粗酶液。测定粗酶液蛋白浓度。所述菌种培养过程为将菌种划线于LB平板，30°C培养至出现单菌落，用牙签挑取单菌落于种子培养基(20mL LB/100mL锥形瓶)，30°C、220rpm振荡培养24h，以1%的接种量接入扩大培养基(IL LB/3L锥形瓶)，30°C、220rpm培养12h ；所述菌液离心条件为8000rpm，4°C，离心lOmin。菌体破碎后离心条件为 8000-12000rpm，O-1OO，离心 10_30min ；所述蛋白浓度测定方法为bradford法(1970)。(2)固定化酶的制备称取一定量纤维素，预处理后与粗酶液于磷酸缓冲液中进行反应，使酶固定在纤维素表面，制备得到固定化酶，测定其活力。所述纤维素为DEAE—纤维素、CM—纤维素或DEAE—纤维素与戊二醛交联载体。预处理方法分别为=DEAE-纤维素预处理，加入适量去离子水浸泡搅拌过夜后，经布氏漏斗抽滤掉去离子水。加入适量0. 5mol/L HCl处理Ih后，抽滤掉多余HC1，去 离子水反复清洗至中性。随后加入适量0. 5mol/LNa0H处理Ih后，抽滤掉多余NaOH，去离子水反复清洗至中性； CM-纤维素预处理，加入适量去离子水浸泡搅拌过夜后，经布氏漏斗抽滤掉去离子水。加入适量0. 5mol/L NaOH处理Ih后，抽滤掉多余NaOH，去离子水反复清洗至中性。随后加入适量 0. 5mol/L HCl处理Ih后，抽滤掉多余HC1，去离子水反复清洗至中性；称取0. 5g DEAE-纤维素，加入25ml戊二醛(浓度分别为1%、3%、6%)，于30°C、220rpm下交联6h。离心去除上清， 并用去离子水反复清洗至无戊二醛残留，去除多余去离子水，制得交联载体；所述反应条件为ρΗ3·0-8·0，反应温度0-25°C，反应时间2_12h，酶的量为2_15mg 酶/g湿重纤维素；所述酶活力测定方法如下游离酶活力测定5ml游离酶中加入5ml浓度为8mg/ml葛根素转化液(ρΗ8· 0)，于 30°C、220rpm下反应12h，HPLC分析测定酶活。固定化酶活力测定固定化酶中加入IOml浓度为4mg/ml葛根素转化液(pH8. 0), 于30°C、220rpm下反应12h，HPLC分析测定酶活。+ 粗_活力-上清中酶活力-洗液中酶活力 W 疋化率=-1! *-X100,丁固定化_总活力ιηΛ活力_收牟=加入酶总活力1X100固定化酶相对活力是指在同组试验中以活性最高的为100，其余固定化酶之比值，以百分数表示。酶活力定义每小时催化产生Iumol糖基化葛根素所需酶量定义为一个酶活力单位(IU)。(3)糖基化葛根素的制备在搅拌条件下，将葛根素溶于缓冲液中，与步骤(2)制备的固定化酶进行转化反应，处理转化液。所述转化反应体系的条件为pH3. 0-8. 0，温度5_50°C，时间1_24小时；所述转化液处理方法为转化液于8000rpm下离心lOmin，取上清，100°C恒温加热IOmin后，于12000rpm下离心IOmin,取上清。(4)糖基化葛根素的纯化 采用普通湿法装柱，将预处理好大孔树脂填充至层析柱。将步骤(3)制备的转化液经层析系统分离，洗脱液经HPLC检测，将糖基化葛根素检测纯度大于95%的洗脱液经旋转蒸发仪浓缩，再经冷冻干燥获得高纯度的糖基化葛根素。所述大孔树脂预处理过程为层析柱内加入相当于装填树脂体积O. Γ0. 5倍的乙醇或甲醇，然后将新树脂投入层析柱中。使其液面高于树脂层约O. 3m处，并浸泡24h。用两倍体积的乙醇或甲醇，以2倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡4 5h。用乙醇或甲醇，以2倍体积/小时的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色混浊止。并以水以同样流速洗净乙醇或甲醇。用2倍体积的5%HC1溶液，以4 6倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡2 4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。用2倍体积的2%NaOH溶液，以4飞倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡2 4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性；所述HPLC检测条件采用Agilent 1100高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentHC-C18柱(250X4. 6 μ m，5 μ m)，柱温为室温；进样体积为20 μ L ;检测器为AgilentG1314A紫外检测器，波长为254nm，；流动相A :经O. 22本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）粗酶液的制备将氧化微杆菌（Microbacterium?oxydans?）CGMCC?1788培养至OD600?1.0—3.0，离心收集菌体，加预冷pH8.0的磷酸缓冲液重悬，破碎两次，离心得粗酶液；?（2）固定化酶的制备称取一定量纤维素，预处理后与粗酶液于磷酸缓冲液中进行反应，使酶固定在纤维素表面，制备得到固定化酶;（3）糖基化葛根素的制备在搅拌条件下，将葛根素溶于缓冲液中，与步骤（2）制备的固定化酶进行转化反应，反应体系的pH为3.0?8.0，温度5?50℃，时间1?24小时，即制得含糖基化葛根素的转化液；（4）糖基化葛根素的纯化采用湿法装柱，将预处理好大孔树脂填充至层析柱，将步骤（3）制备的转化液经层析系统分离，洗脱液经HPLC分析测定，将糖基化葛根素纯度大于95%的洗脱液浓缩，再经冷冻干燥获得高纯度的糖基化葛根素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘贵友，袁生，孙磊，封建树，黄国栋，崔沂，陆舟，沈娇娇，武秀秀，
申请(专利权)人：南京师范大学，江苏教育学院，
类型：发明
国别省市：
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