本发明专利技术涉及降低由毕赤酵母生产的胰岛素或胰岛素类似物前体分子的O-糖基化水平的方法。本发明专利技术通过破坏蛋白甘露糖基转移酶（PMT）基因提供了包括毕赤酵母尤其是巴斯德毕赤酵母的甲醇营养型酵母的基因工程敲除菌株，且使它们能够生产糖基化减少的异源性蛋白质。本发明专利技术考虑了用于转化甲醇营养型酵母的载体，这些载体包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、和PMT6基因的编码序列。本发明专利技术的PMT失活菌株已经保藏在MTCC，Chandigarh。这些菌株是PMT1/GS115（MTCC?5515）、PMT4/GS115（MTCC?5516）、PMT5/GS115（MTCC?5517）以及PMT6/GS115（MTCC5518）。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及破坏巴斯德毕赤酵母的蛋白甘露糖基转移酶(PMT)基因，从而减少由毕赤酵母生产的胰岛素前体分子的O-糖基化水平。本专利技术提供了甲醇营养型酵母的基因工程敲除菌株，包括毕赤酵母尤其是巴斯德毕赤酵母，能够生产糖基化减少的异源性蛋白质。本专利技术考虑了用于转化甲醇营养型酵母的载体，这些载体包括PMTl、PMT2、PMT4、PMT5、 和PMT6基因的编码序列。
技术介绍
已经在多种微生物表达系统中生产了胰岛素、胰岛素类似物和/或衍生物的重组形式。目前生物体，例如大肠杆菌，酿酒酵母，已经用于商业化生产重组人胰岛素及其衍生物。由于这些系统的某些缺点，例如低表达水平，在下游纯化中的困难等，甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母已经有利地用作蛋白质表达系统。该表达系统提供了若干优点例如高表达，处理简单，生产成本低，高密度培养(US6800606)。因为酵母表达系统易于生长，快速并且可按比例放大，它们是广泛使用的；然而， 一些酵母表达系统产生了不一致的结果，并且有时难以实现高产率。显示较大前途的一种酵母表达系统是甲醇营养型酵母，巴斯德毕赤酵母。与其他真核生物表达系统相比较，因为毕赤酵母不存在与动物细胞培养中生产蛋白质的细菌或病毒污染问题相关的内毒素问题， 它有许多优点(Cino, Am Biotech Lab, May 1999)。虽然多个优点归因于基于酵母的表达系统，例如巴斯德毕赤酵母，这个系统主要的一个缺点是得到蛋白质的翻译后修饰，其随后在终产物中以杂质形式存在，该终产物难以纯化。虽然存在许多已知的蛋白质翻译后修饰，翻译后修饰的最常用形式还是糖基化(Hart G. ff, Glycosylation, Curr. Opin. Cell. Biol 1992;4:1017)。根据表达系统糖基化可以是 N-连接的或 O-连接的(Gemmill TR et al. , Overview of N-and 0-linked oligosaccharide structures found in various yeast species, Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1426:227)。糖基化影响蛋白质构象的稳定性、免疫原性、清除率、 保护避免蛋白质水解以及改善蛋白质溶解度(Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006;24:769)。在酵母中，在高尔基体中糖支链的修饰涉及通过不同的甘露糖酶转移酶进行甘露糖残基的一系列添加(“外部链”糖基化)。所述外部链糖基化的结构是生物体特异性的。这类糖基化通常是不期望的，因为在碳水化合物组成以及分子量两个方面，均会导致重组蛋白质产物的异质性，这可能使蛋白质纯化复杂化。它还可以使蛋白质变成高度免疫原性或可以引起不期望的变应性反应。虽然在改善生物技术制造方面有很大进步，对于每种蛋白质没有统一的解决方案。用于特异性治疗蛋白质的制造方法需要新颖的以及创造性的对问题的解决方案，它们对于该蛋白质或蛋白质家族可以是特异性的。因此，期待以下的基因工程甲醇营养型酵母菌 株，例如巴斯德毕赤酵母，其中可以操纵蛋白质的糖基化，基本上是减少，并且可以从中生产具有哺乳动物样翻译后模式的重组糖蛋白质，而不影响期望的终产物的产率。
技术实现思路
因此，本专利技术涉及减少从甲醇营养型酵母生产的蛋白质的糖基化的方法，所述方法通过失活选自包括PMTl、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的组中的至少一个或多个基因能够实现，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因具有与SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述序列编码蛋白甘露糖基转移酶或其功能性部分；一种包含选自下组的蛋白甘露糖基转移酶基因或其功能性部分的载体，所述组包括 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5 和 PMT6 基因，所述 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5 和 PMT6 基因分别具有与 SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述载体整合到同源基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基转移酶在宿主中，优选在甲醇营养型酵母中的表达；用于生产甲醇营养型酵母的敲除菌株的方法，其中(a) —种载体并入了能够同源重组的核酸序列，所述同源重组的核酸序列包含编码选自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6 的组中的基因的至少一个的目标核酸序列和编码选择标记的核酸序列，所述PMT1、PMT2、 PMT4、PMT5和PMT6分别具有与SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，(b)在允许在所述载体中编码目标基因的DNA与在宿主细胞中编码目标·基因的DNA之间发生同源重组的条件下培养细胞，从而导致破坏宿主细胞中的目标基因，(c) 用失活的目标基因来选择宿主细胞；从上述方法生产的蛋白质；一种甲醇营养型酵母敲除菌株，具有选自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的组中至少一个失活基因，所述PMTl、 PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分别具有与SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80% 同源性的核苷酸序列；如上所述的PMTl基因失活菌株；如上所述的PMT4基因失活菌株；如上所述的PMT5基因失活菌株；如上所述的PMT6基因失活菌株；从如上所述敲除菌株生产的蛋白质；从根据权利要求23所述的敲除菌株生产的蛋白质，其中该敲除菌株是MTCC5515 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5516 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5517 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5518 (保藏日期2010年I月18日)或其任何修饰菌株中的一种；以及根据上面说明中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质显示改变的糖基化。本专利技术涉及生产糖基化减少的蛋白质的方法，所述方法涉及对甲醇营养型酵母菌株进行基因修饰并且使它们能够生产糖基化减少的蛋白质的载体用途。在一个优选实施方式中，本专利技术的失活载体包括编码蛋白甘露糖基转移酶(PMT， 长萜基磷酸甘露糖蛋白甘露糖基转移酶蛋白质，E. C. 2. 4.1. 109)的核苷酸序列或其功能性部分，并且能够破坏或失活甲醇营养型酵母菌株中的蛋白甘露糖基转移酶或功能性部分。 优选的核苷酸序列是在SEQ ID USEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5中表示的编码 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因的核苷酸序列以及它的功能性部分，其被选择用于破坏在 SEQ ID 6、SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 10 中分别表示的基因。根据在本专利技术中提出的方法，可以将能够表达异源性蛋白质的核苷酸序列引入到甲醇营养型酵母菌株中，该菌株在前面已经以逐步方式用本专利技术的一种或多种载体进行转化。这种酵母菌株可以连续地或同时地用本专利技术的一种或多种载体进行转化。另外，可以用一种或多种本专利技术的失活载体来转化甲醇营养型酵母菌株，这些载体包括如在序列表中表示的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.10 IN 332/CHE/20101.一种减少由甲醇营养型酵母生产的蛋白质的糖基化的方法，所述方法通过失活选自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的组中的至少一个或多个基因能够实现，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因分别具有与SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述序列编码蛋白甘露糖基转移酶或其功能性部分。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述甲醇营养型酵母属于毕赤酵母。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤酵母。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是通过式I表示的 X-B-Y-A 其中， X是包括至少一个氨基酸的前导肽序列， B是胰岛素分子B链的氨基酸序列、它的衍生物或类似物， Y是包括至少一个氨基酸的连接肽， A是胰岛素分子A链的氨基酸序列，它的衍生物或类似物， 并且所述A和B链可以通过氨基酸取代、缺失和/或添加来修饰。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖基化的方式是O-糖基化。6.根据权利要求1所述的方法，其中糖基化减少至少10%至约99%。7.根据权利要求6所述的方法，其中糖基化减少25%。8.根据权利要求6所述的方法，其中糖基化减少65%。9.一种包含蛋白甘露糖基转移酶基因或其功能性部分的载体，所述蛋白甘露糖基转移酶基因或其功能性部分选自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的组，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因分别具有与SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述载体整合到同源基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基转移酶在宿主中，优选在甲醇营养型酵母中的表达。10.一种减少或改变甲醇营养型酵母生产的蛋白质上的糖基化的方法，包括用权利要求9所述的载体转化所述酵母。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述甲醇营养型酵母属于毕赤酵母。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤酵母。13.一种用于生产甲醇营养型酵母的敲除菌株的方法，其中(a)—种载体并入了能够同源重组的核酸序列，所述同源重组的核酸序列包含编码选自包括PMT...
【专利技术属性】
技术研发人员：纳加拉杰·戈文达帕，科玛尔·卡诺贾，克里希纳穆尔蒂·文卡特森，尼特斯·戴夫，穆克什·巴布阿帕·帕塔勒，桑贾伊·蒂瓦里，克达纳斯·N·萨斯特里，哈里什·耶尔，
申请(专利权)人：拜康有限公司，
类型：
国别省市：
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