使用具有编码肽酶的基因的减弱表达的肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸的方法技术

本发明专利技术提供了使用经修饰减弱选自pepA、pepB和pepD基因的一种或多种基因的表达的肠杆菌科的细菌，特别是属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌产生L-氨基酸如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及微生物工业，并具体涉及产生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸的方法。本方法使用经修饰减弱编码肽酶的基因的表达的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌。
技术介绍
常规地，L-氨基酸在工业上通过利用来自自然来源的微生物菌株或其突变体的发酵方法产生。通常，所述微生物经修饰而增强L-氨基酸的生产收率。已报道了许多增强L-氨基酸生产收率的技术，包括通过用重组DNA(参见，例如美国专利号4，278，765)转化微生物。其他增强生产收率的技术包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性，和/或使由产生的L-氨基酸造成的反馈抑制的靶酶脱敏(参见，例如，W095/16042 或美国专利号 4，346，170 ;5，661，012 和 6，040，160)。其它增强L-氨基酸生产收率的方式是减弱一种或几种涉及靶L-氨基酸的降解的基因，使靶L-氨基酸的前体从L-氨基酸的生物合成途径转向的基因，涉及碳、氮和磷通量的重新分配的基因，以及编码毒素的基因等的表达。来自大肠杆菌(Escherichia coli)的pepA基因(同义词carP)编码组合了催化和调节特性的多功能酶氨肽酶A(PepA)。已显示除了水解蛋白质的N端氨基酸残基之外，还需要氨肽酶A进行位点特异性DNA重组和质粒多聚体的单体化(monomerization)(Stirling 等(1989)EMB0 J.，8，1623-1627;Charlier 等(1995)J.Mol.Biol.，250，392-406)。另一种氨肽酶A功能是转录调节。P印A是DNA结合蛋白，并涉及调控氨甲酰磷酸合酶的合成的carAB操纵子的转录抑制(Roovers等，(1988) J. Mol.Biol.，204，857-865)。氨甲酰磷酸是L-精氨酸和嘧啶生物合成途径的中间体。氨甲酰磷酸和L-鸟氨酸之间的相互作用导致L-瓜氨酸形成，其通过L-精氨琥珀酸转化为L-精氨酸。来自大肠杆菌的P印B基因(同义词yhfI，b2523，ECK2520)编码氨肽酶B (PepB)，其为大肠杆菌中的四种半胱氨酰甘氨酸酶(cysteinylglycinase)之一。氨肽酶B在体外切割 Leu-Gly, Leu-Gly-Gly, Cys-Gly 和 Leu-Gly (Miller 等(1994) Journal of Bacteriology, 176, 610-619, Hermsdorf 等(1979)International Journal of Peptideand Protein Research, 13，146-151，Suzuki 等(2001)Bioscience.Biotechnology.Biochemistry.，5，1549-1558)。在体内，氨肽酶B与氨肽酶A和N，以及二肽酶D —起，为四种半胱氨酸甘氨酸酶之一(Suzuki 等，(2001) Journal of Bacteriology2001; 183 (4) 1489-1490)。二价阳离子，包括一些并非活性的有效刺激剂的，稳定化氨肽酶免受热失活(Suzuki等(2001)Bioscience. Biotechnology. Biochemistry. , 5, 1549-1558.)。来自大肠杆菌的P印D基因(同义词P印H ，肌肽酶)编码肽酶D，其为能够分解多种具有未封闭的(unblocked)N端的二肽,包括半胱氨酰甘氨酸的二肽酶(Schroeder等，(1994)FEMS Microbiology Letters,123, 153-159, Suzuki 等，(2001)Journal ofBacteriology, 183, 1489-1490)。月太酶 D 作为 PepD 单体的二聚体起作用(Klein 等，(1986)Journal of General Microbiology, 132，2337-2343)。在磷酸盐饥饿过程中，pepD 的转录增加至五倍(Henrich 等，(1992)Molecular General Genetics, 232，117-125)。然而，目前并无减弱编码肽酶的基因的表达·用于产生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸的报道。本专利技术的公开本专利技术的诸方面包括增强能够产生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-赖氨酸的菌株的生产率，并提供使用这些菌株产生此种L-氨基酸的方法。 上述诸方面通过发现使编码肽酶P印A，pepB,和/或pepD的基因失活可增强L-氨基酸，如L-精氨酸和L-赖氨酸的产生而实现。此外，因为L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途径中的中间物，所以亦可增强此L-氨基酸的产生。本专利技术提供了具有增加的产生L-氨基酸如L-精氨酸和L-瓜氨酸的能力的肠杆菌科的细菌。本专利技术的一个方面是提供具有产生L-氨基酸能力的肠杆菌科的细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了选自下组的一种或多种基因的表达pepA, pepB,和pepD基因。本专利技术的另一个方面是提供如上所述的细菌，其中所述基因的表达通过使所述基因失活来减弱。本专利技术的另一个方面是提供如上所述的细菌，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。本专利技术的另一个方面是提供根据权利要求3的细菌，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。本专利技术的另一个方面是提供如上所述的细菌，其中所述细菌属于泛菌属(Pantoea)。本专利技术的另一个方面是提供如上所述的细菌，其中所述L-氨基酸选自下组L_精氨酸，L-瓜氨酸和L-赖氨酸。本专利技术的另一个方面是提供如上所述的细菌，其中所述细菌经修饰减弱pepA，pepB和P印D基因的表达，且所述L-氨基酸是L-赖氨酸。本专利技术的另一个方面是提供产生L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养如上所述的细菌；和从培养基收集所述L-氨基酸。本专利技术的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自下组L_精氨酸，L-瓜氨酸和L-赖氨酸。附图说明图1显示了引物对Pl和P2在质粒pMW118-attL-Cm_attR上的相对位置。图2显示包含失活的P印A基因的染色体DNA片段的构建。实施方式的说明本专利技术如下详述。1.细菌根据本专利技术公开的主题的细菌是具有产生L-氨基酸如L-精氨酸，L-瓜氨酸或L-赖氨酸的能力的肠杆菌科的细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了选自下组的一种或多种基因的表达编码氨肽酶的P印A，P印B和P印D基因。术语“具有产生L-氨基酸的能力的细菌”可意指当在培养基中培养细菌时，能够产生L-氨基酸并将其分泌入培养基的细菌。术语“具有产生L-氨基酸的能力的细菌”亦可意指能够产生L-氨基酸如L-精氨酸，L-瓜氨酸或L-赖氨酸，并导致所述L-氨基酸在培养基中以大于大肠杆菌的野生型或亲本株(如大肠杆菌K-12)的量蓄积的细菌，并且可意指所述微生物能够在培养基中造成不少于O. 5g/L,在另一个实施例中不小于1. Og/L的L-氨基酸的量的蓄积。术语“L-氨基酸”可包括L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸。 肠杆菌科包括属于埃希氏菌(Escherichia)属、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.03 RU 20101226471.一种具有产生L-氨基酸能力的肠杆菌科细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了选自下组的一种或多种基因的表达pepA, pepB,和pepD基因。2.根据权利要求1的细菌，其中所述基因的表达通过使所述基因失活来减弱。3.根据权利要求1或2的细菌,其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。4.根据权利要求3的细菌,其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)。5.根据权利要求1或2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：DV菲利波夫，TV利奥诺瓦，EB沃罗希洛瓦，MM古斯亚蒂纳，守屋美加，长井由利，野口景子，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：
国别省市：