本发明专利技术涉及属于埃希氏菌属的产L-苏氨酸细菌以及生产L-苏氨酸的方法，具体的涉及公开了一种使用属于埃希氏菌属的细菌生产L-苏氨酸的方法，其中所述细菌已受到修饰以增强天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过发酵生产L-氨基酸的方法，更具体地涉及有助于这种发酵的源自大肠杆菌(Escherichia coli)的基因。所述基因可以用来提高L-氨基酸生产,具体地，例如，用来提高L-苏氨酸的生产。
技术介绍
传统上，L-氨基酸是通过利用获自天然来源的微生物菌株或其突变体的发酵方法进行工业生产的，这些菌株受到修饰以提高L-氨基酸的产量。 已经报道过许多提高L-氨基酸产量的技术，包括用重组DNA转化微生物(例如参见美国专利号4，278，765)。其它提高产量的技术包括提高涉及氨基酸生物合成的酶的活性和/或使所得的L-氨基酸的反馈抑制的靶酶脱敏(例如参见WO 95/16042或美国专利4，346，170; 5，661，012 和 6，040，160)。可用于发酵生产L-苏氨酸的菌株是已知的，其中，某些菌株中涉及L-苏氨酸生物合成的酶的活性提高(美国专利5，175，107; 5，661，012; 5，705，371; 5，939，307;EP0219027)，某些菌株耐受化学药物如L-苏氨酸及其类似物(W00114525A1,EP301572A2, US 5，376，538)，某些菌株中受产物L-氨基酸或其副产物的反馈抑制的靶酶被脱敏(美国专利5，175，107; 5，661，012)，某些菌株中苏氨酸降解酶失活(美国专利5，939，307; 6, 297, 031)。已知的产苏氨酸菌株VKPM 8-3996(美国专利5，175，107和5，705，371)是目前已知的最好的产苏氨酸菌。该菌株为大肠杆菌(Escherichia coli),于1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (Dorozhny proezd. I, Moscow 113545, RussianFederation)，保藏号B-3996。为了构建菌株VKPMB-3996，将下述几种突变和质粒导入亲本大肠杆菌K-12(VKPM B-7)。突变体thrA基因(突变thrA442)编码耐受苏氨酸的反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。突变体ilvA基因(突变ilvA442)编码活性降低的苏氨酸脱氨酶，其导致异亮氨酸生物合成的速率降低并且导致异亮氨酸饥饿的渗漏(leaky)表型。在包含ilvA442突变的细菌中，thrABC操纵子的转录不被异亮氨酸所抑制，因此对于苏氨酸生产非常有效。tdh基因的失活导致苏氨酸降解被阻止。将蔗糖同化作用的遗传决定子(scrKYABR基因)转移给所述菌株。为了提高控制苏氨酸生物合成的基因的表达，将含有突变体苏氨酸操纵子thrA442BC的质粒pVIC40导入中间菌株TDH6。该菌株发酵期间积聚的L-苏氨酸的量可以高达85g/l。本专利技术人获得了相对于大肠杆菌K-12的突变体thrR (本文称作rhtA23)，其在基本培养基中具有对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的耐受性(resistance) (Astaurova,O. B.等，Appl.Bioch.And Microbiol.，21，611-616 (1985))。在分别产生 L-苏氨酸(SU 专利号 974817)、高丝氨酸和谷氨酸(Astaurova, O. B.等，Appl.Bioch.And Microbiol. ,27，556-561,1991, EP 1013765A)的大肠杆菌菌株例如菌株VKPM B-3996中，上述突变导致这些氨基酸产量的提高。另外，本专利技术人揭示rhtA基因存在于大肠杆菌染色体ISmin上，邻近编码谷氨酰胺转送系统组分的glnHPQ操纵子，并且所述rhtA基因与位于pexB和ompX基因之间的 0RFl(ybiF 基因，在 GenBank 登录号 AAA218541，gi :440181 中的第 764-1651 位)相同。表达ORFl编码的蛋白的单元已被命名为rhtA (rht:耐受高丝氨酸和苏氨酸)基因。另夕卜，本专利技术人发现rhtA23突变是相对于ATG起始密码子-I位上的A-G取代(ABSTRACTS of17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugationwith 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and MolecularBiology,San Francisco，California August 24-29，1997，abstract No. 457，EP 1013765A) o在苏氨酸生物合成主流途径的优化条件下，可以通过向产苏氨酸菌株补充递增量的苏氨酸远源前体(distant precursor),如天冬氨酸,来进一步改良该产苏氨酸菌株。 已知天冬氨酸(aspartate)是天冬氨酸家族氨基酸(苏氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸)以及二氨基庚二酸(diaminopimelate)(参与组成细菌细胞壁的一种化合物)合成的碳的供体。这些合成都要经历一条具有若干分枝点和极其敏感的调控方案的复杂途径，在分枝点上(天冬氨酸，天冬氨酸半醛，高丝氨酸)存在着同工酶，其种数与从这一生物合成步骤所衍生的氨基酸一样多。由thrABC操纵子的一部分编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I促成苏氨酸生物合成的第一和第三个反应。苏氨酸和异亮氨酸调节天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的表达，并且苏氨酸还抑制催化上述两个反应的活性(Escherichia coli andSalmonella，Second Edition，Editor in Chief F. C. Neidhardt, ASM Press, WashingtonD. C.，1996) oasd基因编码天冬氨酸-β -半醒脱氢酶(Asd;EC I. 2. I. 11),其是赖氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸和二氨基庚二酸生物合成途径的关键酶。天冬氨酸-β -半醛脱氢酶伴随着NADP的还原可逆地将L-天冬氨酰-4-Ρ转变成L-天冬氨酸半醛。美国专利6，040，160公开了 asd基因扩增对于大肠杆菌菌株的L-赖氨酸(属于天冬氨酸家族)生产的影响。EP0219027A公开了天冬氨酸-β -半醒脱氢酶可以用于棒状杆菌(coryneform bacteria)的L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸的生产。不过，到目前为止，尚无利用具有增强的天冬氨酸-β -半醛脱氢酶活性的属于埃希氏菌属的细菌来生产L-苏氨酸的报道。专利技术概述本专利技术的一个目的是提高产L-苏氨酸菌株的产率以及提供一种利用这些菌株生产L-苏氨酸的方法。上述目的已经通过克隆在低拷贝载体上的编码天冬氨酸半醛脱氢酶的asd基因可提高L-苏氨酸生产这一发现而得以实现。由此，本专利技术已告完成。本专利技术的一个目的是提供属于埃希氏菌属的产L-苏氨酸细菌，其中所述细菌已经受到修饰以增强天冬氨酸-β -半醛脱氢酶的活性。本专利技术的另一目的是提供上述的细菌，其中通过提高天冬氨酸_β -半醛脱氢酶基因的表达而增强天冬氨酸-半醛脱氢酶的活性。本专利技术的另一目的是提供上述的细菌，其中通过增加天冬氨酸-β_半醛脱氢酶基因的拷贝数或修饰所述基因的表达控制序列来提高基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产L？苏氨酸的方法，其包括：在培养基中培养属于埃希氏菌属的产L？苏氨酸细菌以使L？苏氨酸在所述培养基中积累，其中所述细菌已受到修饰而通过提高天冬氨酸？β？半醛脱氢酶基因的表达来增强天冬氨酸？β？半醛脱氢酶的活性，其中所述细菌已进一步受到修饰以增强突变thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表达，所述突变thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶Ⅰ且其耐受苏氨酸的反馈抑制，所述thrB基因编码高丝氨酸激酶，所述thrC基因编码苏氨酸合酶，所述rhtA基因编码赋予对高丝氨酸和苏氨酸的耐受性的蛋白；和从所述培养基中收集L？苏氨酸，其中通过将所述基因置于强启动子的控制下和/或通过提高所述基因的拷贝数来增强所述基因的表达，其中将天冬氨酸？β？半醛脱氢酶基因置于其下的所述启动子选自由trp启动子、trc启动子、PR启动子和PL启动子组成的组，其中所述天冬氨酸？β？半醛脱氢酶基因编码包含SEQ？ID？NO:2的氨基酸序列的蛋白质。
【技术特征摘要】
2003.12.05 RU 2003135292;2004.07.09 US 60/586,2221.一种生产L-苏氨酸的方法，其包括 在培养基中培养属于埃希氏菌属的产L-苏氨酸细菌以使L-苏氨酸在所述培养基中积累，其中所述细菌已受到修饰而通过提高天冬氨酸-半醛脱氢酶基因的表达来增强天冬氨酸-P -半醛脱氢酶的活性，其中所述细菌已进一步受到修饰以增强突变thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表达，所述突变thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I且其耐受苏氨酸的反馈抑制，所述thrB基因编码高丝氨酸激酶，所述thrC基因编码苏氨酸合酶，所述rhtA基因编码赋予对高丝氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：瓦莱里Z阿克维迪安，埃卡特里纳A萨夫拉索瓦，阿拉M卡普兰，安德雷O洛巴诺夫，尤里I科兹洛夫，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：
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