本发明专利技术涉及降压肽的制备方法技术领域，具体涉及一种中华鳖通过混合酶解‑膜过滤的方法制备降压肽，主要包括原料预处理、混合酶水解、灭酶、离心过滤、膜过滤、冻干等关键步骤，其中混合酶水解过程中混合酶的各配方质量百分数为：木瓜蛋白酶39‑44％、中性蛋白酶28‑33％、胰蛋白酶24‑28％。采用本发明专利技术混合酶水解方法制备，酶利用高，中华鳖降压肽转化率高，中华鳖降压肽的抑制率也较高，同时混合酶水解和膜过滤两个过程可以采用连续式进行，达到连续化的操作，易于工业化生产，提高生产效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及降压肽的制备方法
，具体涉及一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法。
技术介绍
中华鳖(Pelodiscussinensis)俗称甲鱼、团鱼，主要产于中国、日本及东南亚等国家和地区，中华鳖养殖业是我国淡水产养殖业的重要组成部分，也是水产养殖业中经济效益较高的养殖种类。中医药学认为，中华鳖有滋阳凉血、益肾壮阳、清热散结、益气健胃功效，中华鳖的肉、血、卵、胆、脂肪、甲、尿均可入药，适用于骨蒸劳热、久疟久痢、脱肛等疾病。中华鳖是传统的健康养生食品，经常食用有延年益寿功效，深得广大消费者的青睐。
血压是血液在血管内流动时对血管壁所施加的压力，高血压病是一种动脉血管压力升高的慢性疾病，它最大的危害在于对全身血管造成长期超极限的额外压力，导致血管的脆性损伤，最终引起血管的破裂、堵塞，各种心脑血管疾病、肾脏病、眼底疾病、神经系统疾病等都可由它引起，高血压病是导致中老年人死亡的罪魁祸首之一。据国际高血压学会发表的新闻公报(2009年)，全球大约有9.72亿人患高血压或血压偏高症，相当于世界成年(18周岁以上)人口的26.4％，中国成人高血压患病率为25.2％，其高患病率、致死率严重威胁着人类的健康。
降压肽最早是1965年由Ferriera首次从南美洲蝮蛇的毒液中发现。研究者证明，血管紧张素转换酶(AngiotensinI-convertingenzyme，ACE)通过对肾素-血管紧张素-醛固酮系统(ReninAngiotensinSystem，RAS)和血管舒缓激肽-激肽-前列腺素系统(BradykininKininSystem，BKS)的控制实现对人体血压进行调节，其生理过程如图1所示。
ACE抑制剂(ACEI)的作用是通过抑制ACE的活性，使血管紧张素Ⅱ的生成和激肽的破坏均减少，从而达到降低血压的目的。ACEI属于竞争性抑制剂，作用于ACE的活性区域，它们与ACE的亲和力比血管紧张素Ⅰ或舒缓激肽更强，而且也不易从ACE结合区释放，使得ACE失去其原有的活性，从而阻碍ACE催化水解舒缓激肽和血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ两种生化反应过程，起到降血压的作用。
目前，生物活性肽生产常用的方法有四种：(1)化学合成法、(2)酶解法、(3)重组DNA技术、(4)发酵法。化学合成法广泛应用于生产高价值的中长肽缺点是成本高，而且在合成过程中可能产生对健康和环境有害的物质；重组DNA技术也被广泛应用，但这种方法需要昂贵的材料和设备，投资大，成本高，其安全性还需进一步检测，且多限于多肽的生产，而生物活性肽大都是短肽，所以重组DNA技术在这方面的应用是有限的；发酵法是选取微生物菌种进行发酵，在发酵过程中产生具有活性的肽序列，该方法生产活性肽安全易操作，但生产时间较长，该法在乳源性活性肽生产方面应用较多；酶法生产活性肽则有许多优点，该法可生产大量短肽，反应条件温和反应过程易于控制，生产时间短，且所用试剂和原料均是食品级的，安全性高。因此，活性肽的研究和生产主要采用酶解的方法进行。
然而传统酶法制备ACE抑制肽存在酶利用率不高、底物过度降解，以及操作不具备连续性等问题，而采用混合酶法-膜过滤使反应尽可能向产物方向进行，因而得到比传统制取工艺更高的转化率，从而制备中华鳖降压肽。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术的上述不足，提供一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法酶利用率高，混合酶有效提高了中华鳖降压肽转化率，同时制备出的中华鳖降压肽抑制作用也得到了提高。
本专利技术所采取的技术方案是：一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：将中华鳖肉绞成肉糜，并加肉糜质量1-10倍的水匀浆，得到以中华鳖肉泥作为底物的底物溶液备用；
(2)混合酶水解：将步骤(1)制得的底物溶液置于温度50-60℃水浴中，调节底物溶液pH8-9.5，加混合酶搅拌酶解2-3小时，得酶解液；
(3)灭酶：将步骤(2)中的酶解液在95-100℃下持续15-20min灭酶处理，得到灭酶后的混合液体；
(4)离心过滤：将上述步骤(3)得到的液体，采用4500-5000r/min转速离心10-30min，得上清液；
(5)膜过滤：调步骤(4)的上清液pH7-7.5，并在压力0.2-0.25MPa、温度20-30℃条件下，经超滤膜或纳滤膜超滤，收集分子量小于1000Da的超滤液；
(6)冻干：将步骤(5)中的超滤液进行冷冻干燥，即得到中华鳖降压肽。
所述混合酶水解和膜过滤过程可以同时连续进行的，连续操作的具体装置设计如图2所示，其中膜过滤组件包括调节pH、纳滤脱盐等步骤，同时在产品出口处截留的分子量大的部分还可以回到原料液进行再次酶解，提高生产效率。
作为优选，步骤(2)中混合酶的各配方质量百分数如下：木瓜蛋白酶39-44％、中性蛋白酶28-33％、胰蛋白酶24-28％，因为ACE是小分子肽，通过混合酶的酶解作用更有利于获得小分子的短肽，混合酶的同时加入起到加快水解长链得到短肽的目的，同时混合酶生产出来的ACE抑制酶的活性较高。
作为优选，步骤(2)中将底物溶液加水调节质量分数为4-8％，混合酶加入量为底物总质量的1-3％，单个酶只能水解底物的某一部位，所以对于水解来说利用率不高，而混合酶同时切入的位点多，有利于得到较多的小片段肽，此时酶的水解作用最充分，水解能力最高，而且三种酶的利用率因其相互促进和协调也得到提升。
步骤(3)中酶解液在95-100℃下持续15-20min进行灭酶处理，使灭酶过程更彻底。
作为优选，在所述步骤(5)膜过滤之前，将步骤(4)得到的上清液中加水使其多肽浓度为2-3％，因为随着酶解作用的进行，溶液中多肽浓度逐渐升高，稀释上清液有利于在膜过滤中减小膜承受的压力，防止膜通道的堵塞，有利于后续的膜分离。
作为优选，所述步骤(5)得到超滤液后还包括纳滤脱盐：将步骤(5)得到的超滤液加水调节使其多肽浓度为2-3％，并在压力0.5-0.6MPa、温度20-30℃的条件下纳滤脱盐。因为在调整pH过程加入酸或碱导致溶液中有盐类物质残留，且酶解后有部分离子产生，纳滤脱盐步骤能够将脱盐和短肽的过滤浓缩同步进行，对低分子量降压肽和盐的分离有很好效果。优选当分子量5000Da左右的物质较多时，采用超滤膜过滤，然后再经过纳滤膜超滤；当分子量在1000Da左右的物质较多时，直接采用纳滤膜超滤。
采用以上制备方法后，本专利技术的一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法与现有技术相比具有以下优点：
1.本专利技术采用混合酶水解的制备方法，提高了中华鳖降压肽的抑制率，混合酶水解方法制备的降压肽转化率也较高，利用混合酶可生产大量短肽，反应条件温和、易于控制，所得产品品质好；
2.膜过滤组件的过滤过程兼具分离、浓缩、纯化和精制的功能，通过膜过滤的方法有效分离出小分子物质中华鳖降压肽，同时纳滤脱盐步骤提高最终降压肽产品的纯度，不仅使得降压肽品质更好，而且最终产品的得率也有所提高；
3.所述混合酶水解和膜过滤过程可以同时连续进行，连续操作的具体装置设计如图2所示，截留的分子量大的部分还可以回到原料液进行再次酶解。将混合酶水解和膜过滤两本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种混合酶解‑膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法包括以下步骤：(1)原料预处理：将中华鳖肉绞成肉糜，并加肉糜质量1‑10倍的水匀浆，得到以中华鳖肉糜作为底物的底物溶液备用；(2)混合酶水解：将步骤(1)制得的底物溶液置于温度50‑60℃水浴中，调节底物溶液pH8‑9.5，加混合酶搅拌酶解2‑3小时，得酶解液；(3)灭酶：将步骤(2)中的酶解液在95‑100℃下持续15‑20分钟灭酶处理，得到灭酶后的混合液体；(4)离心过滤：将上述步骤(3)得到的液体，采用4500‑5000r/min转速离心10‑30分钟，得上清液；(5)膜过滤：调步骤(4)的上清液pH 7‑7.5，并在压力0.2‑0.25MPa、温度20‑30℃条件下经超滤膜或纳滤膜超滤，收集分子量小于1000Da的超滤液；(6)冻干：将步骤(5)中的超滤液进行冷冻干燥，即得到中华鳖降压肽。
【技术特征摘要】
1.一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：将中华鳖肉绞成肉糜，并加肉糜质量1-10倍的水匀浆，得到以中华
鳖肉糜作为底物的底物溶液备用；
(2)混合酶水解：将步骤(1)制得的底物溶液置于温度50-60℃水浴中，调节底物溶液pH
8-9.5，加混合酶搅拌酶解2-3小时，得酶解液；
(3)灭酶：将步骤(2)中的酶解液在95-100℃下持续15-20分钟灭酶处理，得到灭酶后的
混合液体；
(4)离心过滤：将上述步骤(3)得到的液体，采用4500-5000r/min转速离心10-30分钟，
得上清液；
(5)膜过滤：调步骤(4)的上清液pH7-7.5，并在压力0.2-0.25MPa、温度20-30℃条件
下经超滤膜或纳滤膜超滤，收集分子量小于1000Da的超滤液；
(6)冻干：将步骤(5)中的超滤液进行冷冻干燥，即得到中华鳖降压肽。
【专利技术属性】
技术研发人员：杨华，张慧恩，戚向阳，陈世达，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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