无色肽酶用于室温下裂解的用途制造技术

用于检测生物样品中革兰氏阳性细菌的存在或不存在的方法。所述生物样品可以获自任何哺乳动物并且至少含有细胞成分。将所述样品与酶裂解剂（如无色肽酶）混合，并且在室温下裂解。然后将氧化铁加入到含有无色肽酶的样品中。将磁场施加于所述样品，并且从细胞成分中提取出核酸。如果存在，使用如聚合酶链反应（PCR）的技术扩增靶核酸，然后用于检测革兰氏阳性细菌的存在或不存在。金黄色葡萄球菌和无乳链球菌是通过本发明专利技术的方法检测的靶细菌的实例。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】无色肽酶用于室温下裂解的用途相关申请的交叉参考本申请要求享有2010年3月16日提交的美国临时专利申请No. 61/314，318的申请日权益，在此将其公开内容引入作为参考。
技术介绍
某些革兰氏阳性细菌物种是已知的致病菌。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是已知在哺乳动物中特别毒的感染的根本原因的两种类型的细菌。这些致病菌的检测对于成功的诊断和治疗是至关重要的。存在许多用于检测致病细菌的方法，其中几种依赖于细菌细胞壁的裂解。裂解后， 随后从细胞成分中提取出核酸，并且在下游过程(如PCR)中扩增。然后将核酸的存在或不存在用作感染的指示。革兰氏阳性细菌的裂解特别困难，部分是因为它们细胞壁的结构。革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌在它们的细胞壁内都含有肽聚糖层。该层由通过肽桥交联的聚糖链组成。然而，在革兰氏阳性细菌中，肽聚糖层内交联的数量、厚度和程度更强。Mahalanabis等，Cell lysis andDNA extraction of gram-positive and gram negative bacteriafromwhole blood in a disposable microfluidic chip (在一次性微流体芯片中来自全血的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞裂解和DNA提取)，Lab Chip，9，2811-17 (2009)。这种更强的肽聚糖层使得革兰氏阳性细菌是对酶裂解的挑战。细菌分解酶无色肽酶是革兰氏阳性细菌的有效裂解剂。然而，它并不是没有缺陷。尽管无色肽酶确实可以有效地裂解革兰氏阳性细菌的细胞壁，但如果在一定的时间段后没有停止其活性，则它将继续裂解进一步的下游分析(如PCR)所需的其他关键的细胞组分。显著提高样品温度是停止无色肽酶的裂解活性的一种方法。这种温度的提高，或者称为热峰，可以停止该酶的任何裂解活性。然而，形成产生这种类型的热的系统是昂贵的并且给诊断平台增加了显著的复杂性。本专利技术通过消除热峰和使用提取方法来停止无色肽酶的裂解活性而克服了这些挑战。专利技术简述本专利技术提供了一种使用无色肽酶作为裂解剂从生物样品中提取核酸的方法。在一个实施方案中，从生物样品开始提取。尽管生物样品含有细胞成分，但它还可能具有其他组分。然后将生物样品与无色肽酶混合，并且在室温下裂解。如在此所用的，将裂解定义为细胞壁和细胞膜通过外部的、机械或非机械方式的破裂。在此所述的方法可以实现裂解，而不使用机械方式。在另一个实施方案中，在18至22°C的特定温度下裂解样品。在进一步的实施方案中，将样品与无色肽酶和10%磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)溶液混合。PBS溶液可以给生物样品提供等渗环境，有助于维持样品内细胞成分的存活力，并且可以进一步提供具有受控PH水平的低盐环境。除了 PBS溶液，本专利技术的其他实施方案还可利用Amies培养基、Stuarts培养基和Tris EDTA作为缓冲剂。裂解后，将样品加入到氧化铁中，并且使用磁场从样品中提取出核酸。提取后，然后将核酸进行扩增，并且检测样品中革兰氏阳性细菌的存在或不存在。通过本专利技术检测的革兰氏阳性细菌是金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。此外，本专利技术的方法可以用于靶向耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。附图简述图I说明了本专利技术的一个实施方案，其利用了取样棉签，该棉签具有可以折断并且留在采样管内的尖端；图IA说明了本专利技术的另一个实施方案，其利用了取样棉签，该棉签具有可以折断并且留在采样管内的尖端。图2是本专利技术的一个实施方案的透视图，其利用了圆柱形采样管，其具有能够容纳生物样品的维形底； 图2A是本专利技术的另一个实施方案的侧视图，其利用了能够容纳生物样品的圆柱形采样管；图2B是能够容纳生物样品的圆柱形采样管的俯视图；图2C是图2沿着A的横截面，其利用了具有能够容纳生物样品的锥形底的圆柱形采样管；图2D是本专利技术的另一个实施方案的侧视图，其利用了能够容纳生物样品的圆柱形采样管；图3是本专利技术的第三个实施方案的透视图，其利用了用于密封采样管的可刺穿盖;图3A是本专利技术的一个实施方案的平面图，其利用了用于密封采样管的可刺穿盖；图3B说明了本专利技术的一个实施方案的侧视图，其利用了用于密封采样管的可刺穿盖；图3C说明了图3沿着B的横截面，其利用了用于密封采样管的含有两层密封膜的可刺穿盖。详述在此描述了使用具有裂解特性的酶裂解细胞的方法。可以通过所讨论的方法裂解任何类型的细胞。在优选的实施方案中，裂解革兰氏阳性细菌。然而，使用本专利技术的方法，革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都可以被裂解。该方法包括从裂解的细菌中提取核酸。然后将提取的核酸用于本领域技术人员已知的目的(即，从其提取核酸的靶物的诊断和检测)。由于核酸用于诊断和检测目的的用途是公知的，因此在此不详细描述用于分离和检测靶核酸的试验等。在优选的实施方案中，靶核酸是DNA。使用在此所述的方法可以裂解任何细菌细胞。因此，本专利技术可用于诊断和检测多种细菌物种。本专利技术中有用的细菌物种的实例包括，但不限于，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和无乳链球菌(GBS)。通过在此所述的方法可以检测的其他细菌物种是砂眼披衣菌(Chlamydia trachoma tis)和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)。使用任何常规方法来收集根据在此所述的方法测试靶细菌的存在或不存在的样品，并且决不限于该样品的来源。可以通过在此所述的方法来分析任何潜在的细菌源。可以通过常规方式，如棉签、抽血、尿样等，来进行样品采集。在一个实施方案中，样品可以获自阴道-直肠擦拭物。在一个优选实施方案中，细菌样品可以获自鼻擦拭物。可以使用上述任一种常规收集方法，从尿液、精液、痰液、血液、唾液、粘液、粪便或源自人和动物的任何其他组织或流体来收集样品。在本专利技术的另一个实施方案中，可以从环境中收集样品，包括但不限于水和土壤样品。使用上述常规方法，如擦拭，来收集这些样品。除了水和土壤，可以通过本领域已知的那些方法来擦拭任何表面或物体并且通过在此所述的方法来分析。本专利技术人充分考虑了使用本专利技术的实施方案来检测整个环境中不同位置的细菌的存在。这包括但决不限于如柜台、门把手、汽车操作杆这类物体的表面，浴室表面和本领域技术人员可能认为含有细菌的环境内的任何其他物理位置。在所述的方法中，使用无色肽酶来裂解细菌，以从该生物体中释放出核酸所述生物体提取自用于检测的样品。所述核酸是样品中靶细菌存在的信号指示。因为已知无色肽酶对提高的盐度是敏感的，因此优选采用在以下详述的某些步骤，以获得和制备用于使用无色肽酶裂解的样品。 在一个实施方案中，通过收集和转移装置来收集样本。图2说明了转移装置的一个实例。该转移装置是其中使用湿棉签收集含有靶生物体的样品(如，MRSA、GBS等)的系统。本专利技术的一个实施方案使用了图I和IA中所示的棉签。湿棉签收集装置的目的是促进现场样品收集并延长收集的生物体的存活力。棉签自身具有构造成获得擦拭样品的顶端103。可以通过本领域普通技术人员公知的方式来设计顶端103。棉签还可以含有孔101，使得擦拭样品部位后，例如，鼻通道的棉签，收集部分可以在收集部位断裂到转移管201 中。图2、2A、2B、2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·海利高斯，L·M·科勒，S·拉马丹，J·寇迪，T·J·赫雷尔，
申请(专利权)人：贝克顿·迪金森公司，
类型：
国别省市：