凝血因子VII 的糖基型制造技术

本发明专利技术涉及凝血因子VII的糖基型。本发明专利技术涉及包含凝血因子VII和其它凝血因子的制剂，所述因子具有改变的天冬酰胺-连接型糖基化模式。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及包含凝血因子VII以及其它具有改变的天冬酰胺连接型糖基化模式的凝血因子的组合物。
技术介绍
与凝血级联反应有关的蛋白包括,例如凝血因子VII,凝血因子VIII,凝血因子IX，凝血因子X，以及蛋白C，它们经证实都可以作为有效治疗剂用于治疗各种病症。因此，对包含这些蛋白并预先确定了临床效力的单一形式可药用配制剂的需求不断增长。由于使用人血浆作为药用产物的来源有诸多不利，优选在重组系统中制备这些蛋白。但凝血蛋白都有多种多样的翻译和翻译后修饰，包括，例如glu残基的天冬酰胺连接的(N-连接的)糖基化；0_连接的糖基化；以及Y-羧基化。当使用异源细胞作为宿主来大量制备所述蛋白时，这些修饰可能存在质或量的差异。特别是，在异源细胞中的制备通常导致糖基型(glycoform)的不同排列，即相同的多肽具有不同的共价连接的寡糖结构。在不同的系统中，治疗性蛋白的寡糖结构的变化至少与致免疫性和体内清除的改变有关。因此，本领域需要能提供凝血蛋白制剂的组合物和方法，尤其是包含重组人凝血因子VII，修饰的凝血因子VII，或凝血因子VII相关多肽的制剂，且所述制剂具有预先确定的糖基型模式。专利技术简述本专利技术涉及包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，它们表现出预先确定的糖基型模式。本文中，凝血因子VII或凝血因子VII相关制剂是指已经从合成它们的细胞中分离出来的多种凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽，包括变体和化学修饰形式，以及经蛋白裂解活化的形式(如凝血因子Vila)。糖基型是指制剂中具有多样化结构、并与凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽共价连接的寡糖链的分布。本专利技术一个方面提供了包含多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺连接的寡糖链并且具有以下一或多种特征(i)约94-100%的寡糖链包含至少一个唾液酸部分；(ii)约0-7%的寡糖链为电中性；(iii)约16%以下(如约6-16% )的寡糖链包含至少一个末端半乳糖残基；(iv)约25%以下(如约6-9% )的寡糖链包含至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基；或(V)约30%以下(如约11-23% )的寡糖链包含至少一个末端半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基。在一些实施方案中，除了(i)-(v)的一或多项以外寡糖链中的所有唾液酸残基与半乳糖经由α2->3键连接；至少部分唾液酸残基除了包含N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)以外，还包含N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc);和/或寡糖链包含岩藻糖残基，它通过α 1_>6键与核心N-乙酰葡糖胺连接。在一个实施方案中，本专利技术包括一种含野生型凝血因子VIIa的制剂，其中约94-100%的寡糖链具有至少一个唾液酸残基，且所有的唾液酸残基都经由α 2->3键与半乳糖连接。在另一个实施方案中，本专利技术包括一种含野生型凝血因子VIIa的制剂，其中约94-100%的寡糖链具有至少一个唾液酸残基，且至少一部分唾液酸残基为N-乙醇酰神经氨酸。在另一实施方案中，本专利技术包括一种含野生型凝血因子VIIa的制剂，其中约94-100%的寡糖链具有至少一个唾液酸残基，且至少部分所述链包含N-乙酰半乳糖胺。本专利技术的制剂因此不包含已从人血浆中分离出来但未在体外经糖苷酶处理而被修饰的野生型凝血因子VII或凝血因子Vila。本专利技术另一方面提供了包含多种凝血因 子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制齐U，其中所述多肽包含天冬酰胺连接的寡糖链且其中至少约2%的寡糖链包含至少一个与天线式(antennary)N-乙酰葡糖胺残基(即，与Man残基经由β 1_>2，4或6键连接的N-乙酰葡糖胺残基)经由α 1->3键连接的岩藻糖。优选至少约5%的寡糖链包含至少一个上述天线式岩藻糖残基；更优选至少约10%或20% ;最优选至少约40%。本专利技术的制剂可包含一或多种下述物质未经修饰的野生型凝血因子VII ;经过化学修饰和/或酶修饰的野生型凝血因子VII ;以及在相对于野生型凝血因子VII的氨基酸序列中包含一或多个改变的凝血因子VII变体。本专利技术的制剂可以衍生自，由其内源性凝血因子VII基因表达凝血因子VII的人类细胞，或经编程而由重组基因表达凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的细胞。本专利技术另一方面提供了包含凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的制剂，所述凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽表现出一或多种改进的功能特性，包括，但不限于，保存稳定性、生物可利用度和/或半寿期都提高。本专利技术另一方面包括对凝血因子VII和凝血因子VII相关多肽的糖基型模式进行测定和/或最优化的方法，包括以下步骤(a)在第一组预定的培养条件下培养能表达凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的细胞；(b)从上述培养中回收凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽，以便获得包含所述多肽的制剂；和(C)分析与所述多肽相连的寡糖的结构，以便确定该制剂的糖基型模式。本专利技术还可包括将步骤(a)的培养条件变为第二组预定培养条件；以及重复所述步骤，直至获得所需的糖基型模式。备选地，所述方法还可包括对制剂进行化学处理或酶处理，以改变寡糖的结构；并重复所述步骤，直至获得所需糖基型模式。所述方法还可以进一步包括以下步骤对具有预定的糖基型模式的制剂进行至少一种检测生物活性或其它功能(如药代动力学特性谱或稳定性)的试验，并将特定的糖基型模式与特定的生物活性或功能特性联系起来。本专利技术另一方面提供了制备包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂的方法，所述凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽具有预定的N-连接的糖基化模式。在一些实施方案中，所述方法通过培养能表达所述多肽的细胞来进行，其中与凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽连接的至少约94%的天冬酰胺-连接型寡糖包含至少一个唾液酸残基，例如，1、2、3、或4个唾液酸残基。在一些实施方案中，所述方法通过培养能表达所述多肽的细胞来进行，其中至少约5%的寡糖链包含至少一个与天线式N-乙酰葡糖胺残基以α1_>3键相连的岩藻糖。在一些实施方案中，凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽，不管是何种来源，都接受酶处理，以便获得所需糖基型模式。本专利技术另一方面提供了包含本专利技术制剂的药用配制剂以及预防和/或治疗那些应答凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽而出现的综合征的方法。所述方法包括，在增强或抑制凝血效应的条件下，对需要治疗的患者给药所述药用配制剂。在一组实施方案中，在希望增强凝血的情况下，给药凝血因子VII制剂，所述情况如血友病Α，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板减少症，或von Willebrand病；伴有凝血因子抑制剂存在的综合征；外科手术或抗凝血治疗之前、期间、或之后；或受创后。在另一组实施方案中，给药凝血因子VII相关多肽的制剂(即 相对于野生型凝血因子VII具有降低的或改变的生物活性的制剂)以便减少凝血，这类情况例如，接受血管成形术的患者，或罹患以下疾病的患者深部静脉血栓症，肺栓塞，休克，弥漫性血管内凝血(DIC)，与革兰氏阴性内毒素血症相关的肺部和肾脏纤维蛋白沉积，或心肌梗塞。根据本专利技术，还可以在需要改变(如降低)经由组织因子本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备包含多种因子VII多肽或因子VII相关多肽的组合物的方法，所述方法包括使中国仓鼠卵巢(CHO)细胞适应在血清缺失下生长并在生长期和生产期都缺失血清下培养所述细胞。

【技术特征摘要】
2000.10.02 DK PA200001456;2001.02.16 DK PA20010021.制备包含多种因子VII多肽或因子VII相关多肽的组合物的方法，所述方法包括使中国仓鼠卵巢(CHO)细胞适应在血清缺失下生长并在生长期和生产期都缺失血清下培养所述细胞。2.依照权利要求I的方法，其中所述CHO细胞为CHOKl细胞(ATCCCCL61)。3.依照权利要求I或2的方法，其中所述组合物包含选自人S52A-因子VII;人S60A-因子VII ;已经在残基290和291之间蛋白水解切割的因子VII ；已经在残基315和316之间蛋白水解切割的因子VII ;已经氧化的因子VII ;R152E-因子VII，S344A-因子VII，FFR-因子VII和缺少Gla结构域的因子VIla的多肽。4.依照权利要求I至3任一项的方法，其中使所述细胞适应在动物衍生组分缺失下生长并在生长期和生产期都缺失动物衍生组分下培养所述细胞。5.包含多种因子VII多肽或因子VII相关多肽的组合物，其中所述组合物可通过依照权利要求I至4任一项的方法获得。6.依照权利要求5的组合物，其包含多种因子VII多肽或因子VII相关多肽，在血清缺失下在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：汉斯K平格尔，尼尔斯K克劳森，
申请(专利权)人：诺沃挪第克健康护理股份公司，
类型：发明
国别省市：