一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法。首先称取保存的琼脂糖凝胶进行洗涤处理，然后采用环氧氯丙烷活化法进行活化凝胶，得到活化凝胶；将得到的活化凝胶与间隔臂分子N‑羟基琥珀酰亚胺进行手臂连接反应，得到手臂连接的凝胶；将得到手臂连接的凝胶与肽配基进行配基偶联反应；偶联反应所得产物进行处理反应得到凝血因子Ⅷ亲和层析树脂；所得树脂进行洗涤处理，最后于凝胶体积3倍的20％乙醇溶液中在4℃条件下存放。将本发明专利技术产品层析树脂用于从血浆中提取凝血因子Ⅷ，能够快速、特异、高效的纯化凝血因子Ⅷ。

【技术实现步骤摘要】
一、
：本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法。二、
技术介绍
：凝血因子Ⅷ能够十分有效地对甲型血友病患者进行替代治疗。随着各种层析工艺的开发与应用，比活性可以达到10IU/mg蛋白的中纯凝血因子Ⅷ产品开始用于临床治疗。1992年Baxter公司成功推出第一个基因重组的凝血因子Ⅷ产品。尽管基因重组类的凝血因子Ⅷ产品己经有了较好的临床应用效果，但并不意味着我们就要放弃血浆来源的凝血因子Ⅷ。一方面血浆来源的凝血因子Ⅷ成本要低于重组类的凝血因子Ⅷ，而且因为是从人血浆中提取的天然蛋白质，基本没有临床副反应的发生；另一方面，血浆是一种宝贵的资源，除提取凝血因子Ⅷ外，还可以提取人免疫球蛋白、人血白蛋白、人凝血酶原复合物、纤维蛋白原等产品。而且如果以低温离心冷沉淀为起始原料提取凝血因子Ⅷ的话，基本对上述产品的提取没有影响，既提高了血浆的综合利用效率和使用价值，又分摊了单个血液产品的成本。但是，目前从血浆中提取凝血因子Ⅷ过程中，分离技术不甚理想。1959年，美国医生Pool首先观察到在血浆冷沉淀中含有大部分FVIII促凝血活性，并于1965年与Shannon等开发了从密闭无菌系统中自单份血浆分离制备冷沉淀制剂的方法。但是冷沉淀制剂比活不确定、纯度较低、含有颗粒物和血型抗体、可导致过敏反应等。20世纪70年代后开发了以冷沉淀为原料分离纯化的制备方法，生产比活为0.2～10IU/mg蛋白的各种冻干FVIII制剂。到90年代，有两种采用单克隆抗体亲和层析制备的高纯度FVIII制剂面世，产品比活达700～3500IU/mg，几乎不含其他杂蛋白，但容易造成单抗亲和层析中鼠类蛋白的污染。因此，本专利技术利用肽配基和靶蛋白之间类似抗原抗体结合反应的原理及肽配基分子量小，即使脱落也容易在后续的纯化中分离而不对产品造成污染的优势，制备琼脂糖凝胶肽配基亲和层析柱纯化FVIII。琼脂糖是琼脂中不带电荷的中性成分，琼脂糖为白色或微黄色粉末，高亲水性，含有大量羟基，有特殊的胶凝性质，可制成多孔性凝胶，进而用于分离大分子物质，己广泛应用于医药食品、纺织化工等行业，由于其具有很好的生物相容性，又是优良的生物分离介质。间隔臂又称“手臂”，生物分子间的亲和作用有立体特异性，配基结合位点通常位于大分子内部或表面的裂隙深处，若配基直接固定于载体表面则会由于空间位阻导致结合常数下降。不溶性载体亲和纯化的空间位阻大，通常需要引入一定长度的“手臂”分子，以保证亲和配基有合适的空间取向和伸展灵活性，常用的间隔臂分子一般为小于十个碳原子且分子两端具有活性基团的小分子有机物，如二氨基亚胺、氨基己酸、二氨基己烷、琥珀酸、乙二胺等。载体偶联配基后剩余的活性基团仍可通过基团共价结合或电荷离子交换引起不可逆性吸附。因此，应对其进行掩蔽以降低载体的不可逆吸附，良好的封闭剂不仅能封闭载体剩余活性基团和电荷，又不应产生新的活性基团、电荷，如巯基乙醇、氨基乙酸、乙醇胺、巯基乙胺、半胱氨酸、醋酸酐等。为防止不可逆性吸附，应除去凝胶上的氨基及羧基基团，对于氨基采用羧酸酐进行封闭；羧基掩蔽可采用乙醇胺进行封闭。三、
技术实现思路
：本专利技术要解决的技术问题是：为了克服现有从血浆中提取凝血因子Ⅷ产品分离技术中存在的缺陷，本专利技术提供一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法。将本专利技术产品层析树脂用于从血浆中提取凝血因子Ⅷ，能够快速、特异、高效的纯化凝血因子Ⅷ。为了解决上述问题，本专利技术采取的技术方案为：本专利技术提供一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：a、首先称取保存于冰箱中20％乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶；b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.1～0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是湿琼脂糖凝胶重量的3～5倍；然后在25～35℃(优选为30℃)条件下恒温震荡0.5～2h，恒温震荡时振动速度为100～200转/min(优选为150转/min)；震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤(抽滤至无液滴滴下)，然后加入到1mol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的3～5倍；然后在20～30℃(优选为25℃)、180～220转/分(优选为190转/分钟)条件下恒温振荡30～40分钟(优选为35分钟)；震荡后静置30～40min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50％的二甲基亚矾或占沉淀凝胶体积百分比50％的1,4-二氧六环为活化溶剂，并加入占沉淀凝胶体积百分比20％的环氧氯丙烷，在25～35℃(优选为30℃)、180～220转/分(优选为190转/分钟)条件下恒温振荡反应9～12h(优选为10h)；反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；c、手臂连接：将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:5～8(优选为摩尔比l:6)，所述碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍；然后在55～65℃(优选为60℃)、180～220转/分(优选为190转/分钟)条件下恒温振荡1～1.5h(优选为1小时)，进行“手臂”分子键合反应；反应后得到手臂连接的凝胶；d、配基偶联反应：称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔数的肽配基及碳化二亚胺EDC，在25～35℃(优选为30℃)、180～220转/分(优选为190转/分钟)条件下恒温振荡进行配基偶联反应1.5～2.5h(优选为2小时)；e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的1mol/L的醋酸水溶液，在25～35℃(优选为30℃)、100～200转/min条件下恒温振荡2～2.5h；震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤后，采用去离子水洗涤3～4次；每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积；洗涤后加入湿凝胶体积1/2的1mol/L的乙醇胺，接着在25～35℃(优选为30℃)、100～200转/min条件下恒温振荡反应2～2.5h；所得产物即为凝血因子Ⅷ亲和层析树脂；f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20％乙醇溶液冲洗3～4次，每次加入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积；冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20％乙醇溶液中在4℃条件下存放。根据上述的凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法，步骤a中所述琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼脂糖凝胶CL-6B由琼脂糖凝胶微球或葡聚糖凝胶微球替代。根据上述的凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法，步骤d中所述肽配基为肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一种。根据上述的凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法，所述肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC或肽配基RKWNCTDHEYC均按照常规多肽合成方法制备而成。根据上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a、首先称取保存于冰箱中20％乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL‑6B即琼脂糖凝胶CL‑6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶；b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.1～0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是湿琼脂糖凝胶重量的3～5倍；然后在25～35℃条件下恒温震荡0.5～2h，恒温震荡时振动速度为100～200转/min；震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤，然后加入到1mol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的3～5倍；然后在20～30℃、180～220转/分条件下恒温振荡30～40分钟；震荡后静置30～40min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50％的二甲基亚矾或占沉淀凝胶体积百分比50％的1,4‑二氧六环为活化溶剂，并加入占沉淀凝胶体积百分比20％的环氧氯丙烷，在25～35℃、180～220转/分条件下恒温振荡反应9～12h；反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；c、手臂连接：将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N‑羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:5～8，所述碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍；然后在55～65℃、180～220转/分条件下恒温振荡1～1.5h，进行“手臂”分子键合反应；反应后得到手臂连接的凝胶；d、配基偶联反应：称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N‑羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔数的肽配基及碳化二亚胺EDC，在25～35℃、180～220转/分条件下恒温振荡进行配基偶联反应1.5～2.5h；e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的1mol/L的醋酸水溶液，在25～35℃、100～200转/min条件下恒温振荡2～2.5h；震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤后，采用去离子水洗涤3～4次；每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积；洗涤后加入湿凝胶体积1/2的1mol/L的乙醇胺，接着在25～35℃、100～200转/min条件下恒温振荡反应2～2.5h；所得产物即为凝血因子Ⅷ亲和层析树脂；f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20％乙醇溶液冲洗3～4次，每次加入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积；冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20％乙醇溶液中在4℃条件下存放。...

【技术特征摘要】
1.一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a、首先称取保存于冰箱中20％乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶；b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.1～0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是湿琼脂糖凝胶重量的3～5倍；然后在25～35℃条件下恒温震荡0.5～2h，恒温震荡时振动速度为100～200转/min；震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤，然后加入到1mol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的3～5倍；然后在20～30℃、180～220转/分条件下恒温振荡30～40分钟；震荡后静置30～40min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50％的二甲基亚矾或占沉淀凝胶体积百分比50％的1,4-二氧六环为活化溶剂，并加入占沉淀凝胶体积百分比20％的环氧氯丙烷，在25～35℃、180～220转/分条件下恒温振荡反应9～12h；反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；c、手臂连接：将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:5～8，所述碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍；然后在55～65℃、180～220转/分条件下恒温振荡1～1.5h，进行“手臂”分子键合反应；反应后得到手臂连接的凝胶；d、配基偶联反应：称取步骤c所得手臂连接的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈正跃，詹合琴，陈美光，王璐，靳玫，高夏欢，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41