长效凝血因子和生产它们的方法技术

本发明专利技术公开了多肽和编码它们的多核苷酸，所述多肽包含绒毛膜促性腺激素的至少一个羧基端肽(CTP)，所述羧基端肽连接至凝血因子的羧基端，但是没有连接至凝血因子的氨基端。还公开了包含本发明专利技术的多肽和多核苷酸的药物组合物以及使用和生产它们的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
公开了包含与凝血因子的羧基端连接的绒毛膜促性腺激素的至少一个羧基端肽 (CTP)的多肽和编码它们的多核苷酸。也公开包含本专利技术的多肽和多核苷酸的药物组合物 以及使用和生产它们的方法。
技术介绍
凝血因子补偿疗法的发展已经改变了许多具有血友病的个体的生活。血友病是一 组损害身体的控制血液凝固或凝结的能力的遗传性基因障碍。具有血友病的患者不会产生 足够量的有效血液凝固必需的因子VIII或因子IX蛋白。在严重的血友病患者中，即使微 小损伤可以导致持续数天或数周的失血，并且可能不会发生完全愈合，从而导致对关节和 其它器官的虚弱性永久损伤的可能性和过早死亡。 -类血友病（血友病B)是一种X-连接的由因子IX(FIX)基因中的突变所造成的 出血障碍，从而导致FIX的促凝活性的缺乏。血友病B患者具有自发的软组织出血和反复 的关节积血，经常导致摧毁性的关节病（arthopathy)。这些患者的目前治疗方法包括静脉 内施用重组FIX。但是，FIX的成本问题和从循环中相对快速清除的问题使得开发长效FIX 成为一项挑战性的任务。 FVIII和FIX的商业可用性已经导致危及生命的出血发作的改善控制。许多患者 接受预防性疗法，这会降低出血和它的有关并发症的风险。但是，高比例的患者（10-30%) 会发展针对外源性施用的FVIII和FIX的抑制性抗体。FVIIa(它是一种旁路产物）的施用 可以诱导体内稳态并提供对具有抑制性Ab的患者的有效治疗。 重组FVIIa (NovoSeven?).是商购可得的，并且在1996年被批准用于治疗具有 抑制剂的血友病患者中的出血发作。但是，rFVIIa以2. 5小时的终末半衰期被快速地清 除。所以，患者通常需要多次频繁输注（以2-3小时间隔施用2-3剂）以在轻度至中度出 血后达到足够的体内稳态。结果，在开发长效形式的FVIIa中存在许多兴趣，所述长效形式 的FVIIa会延长单次剂量以后止血活性的持续时间并允许频率低得多的给药。长效FVIIa 也会增加长期预防性疗法的可行性。 正在开发用于延长FVIIa的半衰期的不同技术。但是，挑战是，实现该蛋白的延长 的半衰期，同时保留它的生物活性并确保修饰不会诱导显著的免疫原性。
技术实现思路
在一个实施方案中，本专利技术提供了一种CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多 肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种包含CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的药 物组合物，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多肽由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多 肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述 CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧 基端肽（CTP)组成。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种表达载体，其包含编码CTP修饰的多肽 的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的 3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种包含表达载体的细胞，所述表达载体包 含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所 述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种包含表达载体的组合物，所述表达载体 包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至 所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的 方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多 肽的羧基端，由此延长所述FIX多肽的生物半衰期。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种提高因子IX(FIX)多肽的曲线下面积 (AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所 述FIX多肽的羧基端，由此提高所述FIX多肽的AUC。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的施用频率的方 法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多肽 的羧基端，由此降低所述FIX多肽的施用频率。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的清除率的方 法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多肽 的羧基端，由此降低所述FIX多肽的清除率。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种生产CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的方 法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多肽 的羧基端，由此生产CTP修饰的FIX多肽。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方 法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多 肽包含FIX多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)， 由此治疗所述受试者中的血友病。 在一个实施方案中，本专利技术提供了一种预防受试者中的血液凝固或凝结障碍的方 法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血 因子包含连接至所述FVII多肽的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此 预防所述受试者中的血友病。 在另一个实施方案中，本专利技术涉及一种治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方 法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血 因子包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此 预防所述受试者中的血友病。 从下述详细描述实施例和附图将明白本专利技术的其它特征和优点。但是，应当理解， 所述详细描述和具体实施例尽管指出了本专利技术的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出， 因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本专利技术的精神和范围内的各种变化和修改。 【附图说明】 图1A.显示的条形图显示了在有g/ml维生素 K3存在下用FIX-CTP和 FIX-CTP-CTP变体有限稀释的、转染的和选择的细胞的收获物。使用人FIX ELISA试剂盒 (Affinity Biologicals;目录号FIX-AG RU0)定量FIX的水平,计算的蛋白质浓度Og/ ml)是两个独立运行的平均值。图IB显示了 FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显 微照片A描绘了在蛋白质印迹中抗-FIX抗体的识别；显微照片B描绘了在蛋白质印迹中 抗-Y羧化抗体的识别。A-B中的泳道1加载了含有重组FIX的样品。A-B中的泳道2加 载了含有FIX-CTP收获物的样品。A-B中的泳道3加载了含有FIX-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.14 US 13/372,5401. 一种CTP修饰的因子IX (FIX)多肽，其由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多 肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽（CTP)组成。2. 根据权利要求1所述的CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氛基酸序列编码。3. 根据权利要求1-2中的任一项所述的CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP被糖 基化。4. 根据权利要求1-3中的任一项所述的CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP被截 短。5. 根据权利要求1-4中的任一项所述的CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP经由 接头连接至所述FIX多肽。6. 根据权利要求5所述的CTP修饰的FIX多肽，其中所述接头是肽键。7. -种药物组合物，其包含根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的FIX多肽。8. -种多核苷酸，其编码根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的多肽。9. 一种表达载体，其包含根据权利要求8所述的多核苷酸。10. -种细胞，其包含根据权利要求9所述的表达载体。11. 一种组合物,其包含根据权利要求9所述的表达载体。12. -种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给受试者施用根据权利要求 1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽。13. 根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽在制备用于治 疗受试者中的血友病的组合物中的用途。14. 根据权利要求1-6中的任一项所述的CTP修饰的因子IX(FIX)多肽用于治疗受试 者中的血友病的用途。15. -种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期、提高曲线下面积（AUC)、降低施用频率 或降低清除率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连 接至所述FIX多肽的羧基端，由此延长所述FIX多肽的生物半衰期、提高曲线下面积（AUC)、 降低施用频率或降低清除率。16. 根据权利要求15所述的方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。17. 根据权利要求15-16中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被糖基化。18. 根据权利要求15-17中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被截短。19. 根据权利要求15-18中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所 述FIX多肽。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述接头是肽键。21. 根据权利要求15所述的方法，其中所述CTP修饰的FIX多肽的序列是在SEQ ID NO: 31中阐述的序列。22. -种生产CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒 毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此生产CTP修饰的FIX 多肽。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述CTP修饰的FIX多肽的序列是在SEQ ID NO :31中阐述的序列。24. 根据权利要求22-23中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氛基酸序列编码。25. 根据权利要求22-24中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被糖基化。26. 根据权利要求22-25中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP被截短。27. 根据权利要求22-26中的任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所 述FIX多肽。28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述接头是肽键。29. -种预防受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括下述步骤：给所 述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血因子包含连接至所述凝血因子的 羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此预防所述受试者中的血液凝固或 凝结障碍。30. 包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修饰的凝血因子在制备药物中的用途，所述药物用于预防受试者中的血液凝固或凝结 障碍。31. 包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修饰的凝血因子在预防受试者中的血液凝固或凝结障碍中的用途。32. -种治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括下述步骤：给所 述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血因子包含连接至所述凝血因子的 羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此治疗所述受试者中的血液凝固或 凝结障碍。33. 包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修饰的凝血因子在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的血液凝固或凝结 障碍。34. 包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修饰的凝血因子用于治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的用途...

【专利技术属性】
技术研发人员：U·E·菲马，G·哈特，
申请(专利权)人：奥普科生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL