人凝血因子轻链蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术通过体外抑菌活性检测了人凝血因子轻链蛋白抗不同革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度，通过体内抑菌活性检测了人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌的抑制作用，证明了人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用，以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物。通过质谱及银染检测证明了人凝血因子轻链蛋白对内毒素的水解及清除作用，以便开发出一类治疗内毒素血症的新型药物。所述人凝血因子轻链蛋白为人凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ轻链蛋白，以及与它们具有50％以上同源性的蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人凝血因子轻链蛋白及其应用
本专利技术属于生物医药领域，特别涉及人凝血因子轻链蛋白及其在制药中的应用。
技术介绍
革兰氏阴性菌泛指在革兰氏染色反应中呈现红色的细菌。由于细胞壁结构的不同，在革兰氏染色过程中，不同的染料造成了其与革兰氏阳性菌着色的不同(阳性菌为紫色)。革兰氏阴性菌以大肠杆菌为代表，还有变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属等等。该类细菌的致病能力往往与其细胞壁的特殊组分——脂多糖(又叫内毒素)相关。在人体当中，脂多糖会诱导机体产生大量细胞因子并激活免疫系统，最终形成有机体对病原菌的先天性免疫应答。例如红肿就是细胞因子大量产生并释放导致的。在革兰氏阴性菌感染的治疗中，除了清除感染灶及用相应的支持对症治疗外，还需使用抗生素。目前主要采用的是氨基糖苷类、β-内酰胺类等抗生素。这些抗生素对各种革兰氏阴性菌有强大杀菌作用，而且对于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌等常见革兰氏阴性杆菌都具有较长时间的抗生素后效应。除了抗生素以外，如前列腺素合成酶抑制剂、左旋咪唑、吞噬肽等也被用于革兰氏阴性菌感染的治疗。然而，随着抗生素的广泛应用，临床出现的抗生素滥用现象导致细菌的耐药性已经从单类耐药发展成为多重耐药，使大量原本能够有效替代的二线抗生素无效。其次，抗菌药物在杀/抑菌的同时会诱导内毒素的产生，增加了疾病的治疗难度，所以尽管不断有新的杀伤力强的抗生素问世及先进的支持疗法出现，革兰氏阴性菌感染所致的内毒素血症的处理仍是临床上棘手的问题，尤其是其20～30％的死亡率更是令人难以接受。据报道脂多糖是导致革兰氏阴性菌感染后发生的一系列毒性反应的主要病源物。虽然抗生素对清除细菌具有较好的效果，但对已游离于血液中的脂多糖以及由其持续刺激靶细胞产生的多种有害细胞因子无能为力，所以临床选用抗菌药物时应对药敏实验结果及其诱导内毒素释放的特性进行综合考虑。第三，因为脂多糖在革兰氏阴性菌的细胞壁表面，使得很多旧型抗生素不能有效抑制此类细菌。基于这些原因，近年来人们正在积极开拓治疗革兰氏阴性菌感染的新领域。抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPs)是指具有抗菌活性的短肽，这类活性肽多数具有热稳定性、强碱性及广谱抗菌等特点。目前人们已经从不同的生物体中鉴定出约2000多个AMPs，这些AMPs经诱导而合成，在机体抵抗病原体的入侵方面起着重要的作用，被认为是生物非特异性免疫功能的重要防御成分。因此寻找新型抗革兰氏阴性菌的APMs成为研究的热点与难点。人凝血因子VII(humanfactorVII，hFVII)是人体内天然存在的蛋白质，其分子量约为50kD。其分子包含四个结构域：N末端膜结合的γ羧基谷氨酸结构域(Gla结构域)，两个表皮生长因子样结构域(EGF1、EGF2)和一个C端丝氨酸蛋白酶结构域。它在人体内还存在一些序列同源性较高的类似物，如人凝血因子IX(humanfactorIX，hFIX)、人凝血因子X(humanfactorX，hFX)等。迄今为止，尚未见以人凝血因子VII、人凝血因子IX、人凝血因子X三者的轻链作为抑菌药物治疗细菌感染的相关报道及制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供人工制备的人凝血因子轻链蛋白，本专利技术的另一目的是证明所述人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌具有抑制作用，以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物及治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物。本专利技术所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述，或与SEQIDNO：1所述氨基酸序列具有50％以上的同源性的蛋白。与序列表中SEQIDNO：1所述的氨基酸序列具有50％以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所述。或本专利技术所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：2所述，或与SEQIDNO：2所述氨基酸序列具有50％以上的同源性的蛋白。与序列表中SEQIDNO：2所述的氨基酸序列具有50％以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所述。或本专利技术所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：3所述，或与SEQIDNO：3所述氨基酸序列具有50％以上的同源性的蛋白。与序列表中SEQIDNO：3所述的氨基酸序列具有50％以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所述。氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述列的人凝血因子轻链蛋白命名为LhFVII，氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：2所述的人凝血因子轻链蛋白命名为LhFIX，氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：3所述的人凝血因子轻链蛋白命名为LhFX。上述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，由原核重组质粒表达而成，或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。本专利技术所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQIDNO：4所述的核苷酸序列或与序列表中SEQIDNO：4所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQIDNO：4所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：5或SEQIDNO：6所述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)；所述真核载体为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)。本专利技术所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQIDNO：5所述的核苷酸序列或与序列表中SEQIDNO：5所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQIDNO：5所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：4或SEQIDNO：6所述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)；所述真核载体为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)。本专利技术所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQIDNO：6所述的核苷酸序列或与序列表中SEQIDNO：6所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQIDNO：6所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：4或SEQIDNO：5所述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)；所述真核载体为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)。本专利技术所使用的方法：(1)通过PCR反应，获取编码重组LhFVII、LhF本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.29 CN 20131020682351.含有人凝血因子轻链基因所编码的蛋白的药物组合物在制备治疗革兰氏阴性菌所致疾病的药物中的用途，其中，所述蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所述。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述蛋白由原核重组质粒表达而成，或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。


3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述革兰氏阴性菌所致疾病为内毒素血症。


4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋旭，李灵，陈金武，廖东升，马登佼，
申请(专利权)人：成都渊源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51