一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法技术

本发明专利技术公开了一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，包括如下步骤：（1）血浆去冷胶；（2）第一次强阴离子交换柱层析；（3）PEG沉淀去杂蛋白；（4）S/D病毒灭活；（5）第二次强阴离子交换柱层析分别得到FVII洗脱液与FIX洗脱液；（6）弱阴离子交换柱层析纯化凝血FVII；（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX；（8）超滤；（9）加稳定剂及调节；（10）纳米膜除病毒过滤；（11）除菌过滤并分装；（12）冻干；（13）干热病毒灭活。本发明专利技术采用PEG沉淀去杂蛋白，通过离子交换层析结合亲和层析纯化技术，实现了同时制备高纯FVII及FIX的目标，工艺流程简单，生产周期短，产品经三步病毒灭除措施，使用安全性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物制药领域，涉及血液制品的制备，具体讲是涉及一种从去冷胶血浆 中同时制备人凝血因子IX及VII的方法。
技术介绍
人凝血因子VE(FVII)与人凝血因子IX(FIX)均是肝脏合成的维生素K依赖的凝血 因子，前者由406个氨基酸残基组成，分子量约50KD，等电点4. 9,血浆中浓度为0. 5-2mg/ L，后者由416个氨基酸残基所组成，分子量约57KD，血浆中浓度为5mg/L左右。两种凝血 因子在凝血过程中均发挥着非常重要的作用。其中FVII是机体外源凝血途径的始动因子， 无论是原发性的还是继发性的FW缺乏，都有可能造成出血，甚至危及生命，故对于FW缺 乏的患者，输注浓缩的纯化FW，可以纠正其出血倾向，恢复正常的凝血机能。 近年来，重组活化人凝血Vila对血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大 面积外科手术的血具有令人满意的治疗效果，也成为带有凝血因子W或IX抑制物的先天性 A型或B型血友病人的替代疗法。可见人凝血因子VII的临床需求是十分巨大的。而人体 因缺乏凝血FIX则会导致凝血障碍即为乙型血友病，该病是一种遗传性疾病，以自发性或 创伤相关的出血为特征，出血部位主要在关节、软组织和肌肉。治疗的延迟或不足会引起各 种并发症，包括关节反复出血相关的关节病和滑膜炎，严重时可导致关节畸形和功能障碍。 另外，更严重的出血，尤其是颅内出血可能导致死亡。目前治疗乙型血友病唯一有效的方法 就是及时注射含凝血FIX的药物以达到止血的目的，或者定期注射含凝血FIX的药物预防 出血。含凝血FIX的药物有血浆提取的高纯人凝血FIX、人凝血酶原复合物（PCC)以及基因 重组人凝血FIX(辉瑞公司生产的"贝赋"）等，国内目前只有冻干人凝血酶原复合物（PCC) 品种。临床实践表明，乙型血友病人注射高纯人凝血FIX很安全，而注射人凝血酶原复合物 却可能产生严重的副作用一血栓症，所以高纯人凝血FIX是治疗乙型血友病的首选药物， 但传统的高纯人凝血FIX生产工艺，工序复杂，在制备FIX过程中，将宝贵的FVII当作杂质 去除，且在生产过程中易出现凝血酶激活的问题而致产品失败，再加上传统工艺的病毒灭 活手段单一，不能完全保证制品的安全，而干热病毒灭活方式往往导致较大的活力损失。 针对这一现状，本专利技术开发了一种从去冷胶血浆中同时制备高纯FVII及FIX的方 法，本专利技术采用离子交换层析结合亲和层析技术及PEG沉淀去杂，实现了纯化、精制FVII及 FIX的目标，流程简单，生产周期短，FVII与FIX的收率均超过50%。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、产品质量好、得率高、成本低及 生产效率高的能同时制备人凝血因子IX及VII的方法。 1. 一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：包括 如下步骤： (1)去冷胶血浆的制取 将新鲜冰冻血浆融化，在〇-3°C下连续离心，去除冷胶，上清即为去冷胶血浆，后用 颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0. 45Mm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血衆；过 滤前，用缓冲液预洗滤芯；缓冲液由柠檬酸钠、氯化钠及水组成，其中柠檬酸钠浓度为 0. 01M-0. 02M，氯化钠浓度为0. 075M-0. 15M氯化钠，缓冲液PH值为6. 50-7. 50,温度 10-15。。； (2) 第一次强阴离子交换柱层析 步骤（1)得到的澄清去冷胶血浆上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液1平衡；上 柱过程中收集穿透液于带低温冷媒夹套的坦克中，用于后续血制品的加工生产；上柱结束 后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液，即为富含FVII 与FIX的溶液； (3) PEG沉淀去杂蛋白 在步骤（2)收集的洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3-6%，搅拌0. 5-1. 5 小时，后用1. 〇Mm滤芯过滤，收集澄清的滤液； (4)S/D病毒灭活 在步骤（3)收集的滤液中加入Tween80至1. 0% (wt%)，TNBP(磷酸三丁酯）至0· 3% (wt%)，搅匀后升温至24-26°C，后保温6-7小时； (5) 第二次强阴离子柱层析 将上述S/D后的溶液用稀释液稀释到电导率小于15mS/cm(25°C)，然后上强阴离子柱， 柱子预先用平衡缓冲液2平衡；上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液 2A洗脱柱子，所得洗脱液A即为凝血FVII粗品；再用洗脱缓冲液2B洗脱，收集洗脱液B即 为凝血FIX粗品； (6) 弱阴离子柱层析纯化凝血FVII 将上述洗脱液A用稀释液稀释到原来的2-4倍，然后上弱阴离子柱，柱子预先用平衡缓 冲液3平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液3冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液3洗脱柱子，所 得洗脱液即为精制的凝血FVII溶液；用0. 45μπι滤芯过滤得到澄清滤液； (7) 肝素亲和柱层析纯化凝血FIX 将以上洗脱液B用稀释液稀释到电导率小于15mS/cm(25°C)，上肝素亲和柱，柱子预 先用平衡缓冲液4平衡，后用洗涤缓冲液4洗涤，再用洗脱缓冲液4洗脱，收集洗脱液，用 0. 45Pm滤芯过滤，所得滤液即为精制的凝血FIX溶液； (8) 超滤 用5K~10k截留分子量的超滤膜包分别浓缩以上FVII及FIX滤液，并用透析液分别恒 体积透析4-6倍，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包； (9) 加稳定剂及调节 按照所需规格分别调节人凝血FVII的效价及FIX的效价至所需值(一般为20-30IU/ml)，后分别加入稳定剂并分别调PH值至6. 50-7. 50 ; (10) 纳米膜除病毒过滤 分别用15-20纳米滤芯对以上FVII及FIX溶液进行除病毒过滤； (11) 除菌过滤并分装 分别用0. 22Mm滤芯对以上FVII及FIX溶液进行 (12) 冻干 分别冻干以上凝血FVII及FIX原液，得到凝血FVII及FIX冻干粉； (13) 干热除病毒过滤 分别或同时将FVII及FIX冻干品在100°C沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。 2.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的 方法，其特征在于：步骤（2)所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharose FF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种。 3.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的 方法，其特征在于：步骤（2)所述的柱层析所用的平衡缓冲液1组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸 钠，0. 075M-0. 15M氯化钠，PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液1组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸 钠，0· 4M-0. 8M氯化钠，0· 02-0. 04M盐酸精氨酸，PH6. 50-7. 50。 4.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的 方法，其特征在于：步骤（6)所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharose FF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种；步骤（5)所述的平 衡缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）去冷胶血浆的制取将新鲜冰冻血浆融化，在0‑3℃下连续离心，去除冷胶，上清即为去冷胶血浆，后用颇尔公司生产的Supradur 50P滤板串联0.45µm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血浆；过滤前,用缓冲液预洗滤芯；缓冲液由柠檬酸钠、氯化钠及水组成，其中柠檬酸钠浓度为0.01M‑0.02M， 氯化钠浓度为0.075M‑0.15M 氯化钠，缓冲液PH值为6.50‑7.50，温度10‑15℃；（2）第一次强阴离子交换柱层析    步骤（1）得到的澄清去冷胶血浆上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液1平衡;上柱过程中收集穿透液于带低温冷媒夹套的坦克中，用于后续血制品的加工生产；上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液，即为富含FVII与FIX的溶液； （3）PEG沉淀去杂蛋白     在步骤（2）收集的洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3‑6%, 搅拌0.5‑1.5小时，后用1.0µm滤芯过滤，收集澄清的滤液；（4）S/D病毒灭活在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80 至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯） 至0.3%（wt%），搅匀后升温至24‑26℃，后保温6‑7小时；（5）第二次强阴离子柱层析   将上述S/D后的溶液用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上强阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液2平衡;上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液2A洗脱柱子，所得洗脱液A即为凝血FVII粗品；再用洗脱缓冲液2B洗脱，收集洗脱液B即为凝血FIX粗品；（6）弱阴离子柱层析纯化凝血FVII将上述洗脱液A用稀释液稀释到原来的2‑4倍，然后上弱阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液3平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液3冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液3洗脱柱子，所得洗脱液即为精制的凝血FVII溶液；用0.45µm滤芯过滤得到澄清滤液；（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX    将以上洗脱液B用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，上肝素亲和柱，柱子预先用平衡缓冲液4平衡，后用洗涤缓冲液4洗涤，再用洗脱缓冲液4洗脱，收集洗脱液，用0.45µm滤芯过滤,所得滤液即为精制的凝血FIX溶液；（8）超滤用5K~10k截留分子量的超滤膜包分别浓缩以上FVII及FIX滤液，并用透析液分别恒体积透析4‑6倍，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包；（9）加稳定剂及调节按照所需规格分别调节人凝血FVII的效价及FIX的效价至所需值（一般为20‑30IU/ml），后分别加入稳定剂并分别调PH值至6.50‑7.50；（10）纳米膜除病毒过滤分别用15‑20纳米滤芯对以上FVII及FIX溶液进行除病毒过滤；（11）除菌过滤并分装分别用0.22µm滤芯对以上FVII及FIX溶液进行（12）冻干分别冻干以上凝血FVII及FIX原液，得到凝血FVII及FIX冻干粉；（13）干热除病毒过滤分别或同时将FVII及FIX冻干品在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李春洲，
申请(专利权)人：上海洲跃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31