一种液质联用定量检测大鼠血浆中叶酸浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法。首先采用蛋白沉淀处理大鼠血浆样本，以格列本脲为内标运用高效液相色谱‑质谱联用(HPLC‑MS/MS)方法检测大鼠血浆中叶酸的含量。质谱采集方法选用ESI正离子及多反应监测模式(MRM)。该方法叶酸在10～1000ng/ml线性关系良好。方法的回收率在80.0％～95.4％范围内；批内和批间的准确度为92.7％～111.4％，批内和批间精密度为2.6％～8.3％。该方法重现性好，分析时间短，能满足叶酸在大鼠血浆中浓度的检测要求，可用于叶酸片剂药代动力学研究。

A method for quantitative determination of folic acid in rat plasma by liquid chromatography-mass spectrometry

The invention discloses a method for quantitatively measuring the concentration of folic acid in plasma by liquid chromatography. First, using protein precipitation treatment rat plasma samples with glibenclamide as internal standard by high performance liquid chromatography mass spectrometry (HPLC MS/MS) method for detection of plasma folic acid content in rats. ESI positive ion and multi reaction monitoring mode (MRM) were adopted for mass spectrometry. The method has a good linear relationship between 10 and 1000ng/ml. The recovery rate was between 80% and 95.4%. The accuracy between batch and batch was 92.7% to 111.4%, and the precision between batch and batch was 2.6% ~ 8.3%. The method has good reproducibility and short analysis time. It can meet the requirement of folic acid concentration in rat plasma and can be used for the pharmacokinetic study of folic acid tablets.

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用定量检测大鼠血浆中叶酸浓度的方法
本专利技术属于生物分析领域，具体涉及一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法。
技术介绍
叶酸是由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成的水溶性维生素。叶酸在人体内主要参与嘌呤和嘧啶核苷酸的合成和转化，参与构成含铁的血红蛋白，参与蛋白质的代谢等，是细胞生长和繁殖所必需的物质。临床上可以用来预防神经管畸形，还可用于治疗慢性萎缩性胃炎、抑制支气管鳞状转化以及防治因高同型半胱氨酸血症引起的冠状动脉硬化症、心肌损伤与心肌梗塞等。研究表明，叶酸还能抑制肿瘤细胞中癌基因的表达，从而阻断恶性肿瘤的进展。目前叶酸在机体内的检测主要有微生物测定法、放射免疫测定法、色谱分析法等，这些方法都存在一定的局限性，而且也不能满足大批量样本的检测。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的缺陷和不足，本专利技术提供了一种重现性好、灵敏度高、分析速度快的检测血浆中叶酸浓度的方法，此法可用于药代动力学研究，为其临床给药提供有益的参考。一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法，包括步骤(1)样品制备，(2)采用液相色谱-质谱联用检测，(3)标准曲线制备，(4)血浆中叶酸浓度测定。所述步骤(1)样品制备的步骤包括：取待测血浆样本，加入内标工作溶液沉淀蛋白，混匀后加超纯水混匀，低温离心，取上清液。所述内标溶液中内标为格列本脲。所述步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：(a)液相色谱条件色谱柱：C18柱；流动相：0.1％甲酸-水(A)与乙腈(B)；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱梯度程序如下：0～0.5min，5％(v/v)B；2.2～3.2min，95％(v/v)B；3.21～6min，5％(v/v)B。(b)质谱条件质谱采用Agilent6430三重四极杆质谱仪，电喷雾正离子源，多反应监测分析模式(MRM)。所述(a)液相色谱条件中，色谱柱为ThermoAccucoreC18柱(50mm×2.1mm，2.6μm)，样品检测时间：6min；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：40℃。所述(b)质谱条件中，干燥气：N2；干燥气流速：10L/min，干燥气压力：40psi，干燥气温度：350℃，毛细管电压：4000V。MRM监测方法参数如下：定量离子对叶酸：[M+H]+m/z442.2/295.1，碎片电压：100V，碰撞能量：10eV；内标格列本脲：[M+H]+m/z494.2/369.0，碎片电压：130V，碰撞能量：9eV。所述(3)标准曲线制备的步骤包括：分别取100、250、500、1000、2500、5000、10000ng/ml的叶酸标准溶液10μl加入大鼠空白血浆90μl，涡旋得10、25、50、100、250、500、1000ng/ml的标准样本溶液，按步骤(1)样品制备的方法制备，取上清液按步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录每个浓度的叶酸对应的峰面积；以叶酸和内标的峰面积比值为纵坐标，以叶酸的浓度为横坐标X，制备叶酸的线性回归方程。所述(4)大鼠血浆中叶酸浓度测定的步骤包括：将待测血浆按步骤(1)样品制备的方法制备，取上清液按步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录叶酸对应的峰面积，将叶酸和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到所述待测血浆中叶酸的浓度。所述叶酸标准溶液配制：精密称取叶酸10mg，置10ml量瓶中，加5ml二甲亚砜超声溶解，然后用乙腈定容至刻度，配制1mg/ml的储备液，然后用乙腈稀释至100～10000ng/ml的系列标准溶液。所述内标格列本脲标准溶液配制：精密称取10mg格列苯脲置10ml量瓶中，乙腈超声溶解并定容至刻度，配成浓度为1mg/ml的储备液，然后取0.5ml置10ml量瓶中，加乙腈定容至刻度得50μg/ml的内标溶液，最后取50μg/ml内标溶液250μl置250ml量瓶中，加乙腈定容至刻度，得50ng/ml的内标工作溶液。所述的混匀，为采用涡旋混匀1min。所述的低温离心是低温4℃，12000r/min，离心5min。本专利技术所述方法可用于叶酸片剂中叶酸的药代动力学研究。本专利技术的有益效果：本专利技术首次基于HPLC-MS/MS法建立了大鼠血浆的采集、分离分析方法，并成功的应用于SD大鼠灌胃给药叶酸溶液后血浆中叶酸的浓度检测。此方法灵敏度高，重现性好，能满足大批量样本的检测。附图说明图1SD大鼠空白血浆MRM质谱图。图中：A-叶酸，B-内标。图2空白血浆添加叶酸和内标的MRM质谱图。图中：A-叶酸，B-内标。图3大鼠灌胃给药2h后血浆样品添加内标的MRM质谱图。图中：A-叶酸，B-内标。图4大鼠灌胃给药后的药物浓度-时间曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术的技术方案作进一步的详细说明。下述内容仅用于说明本专利技术，但本专利技术不局限于此。1仪器与试剂Agilent1260-6430液相质谱联用系统(LC-MS/MS，安捷伦科技有限公司)。包括G1379B型脱气机，G1312B型二元输液泵，G1367E型自动进样器，G1330B型控温模块，G1316A型柱温箱，6430MS/MS系统及Masshunter数据采集软件。XL16K-T台式高速冷冻离心机，湖南湘立科学仪器有限公司。AdvantageA10Milli-Q超纯水机，默克化工技术(上海)有限公司。VortexGenius3涡旋仪，广州仪科实验技术有限公司。叶酸(纯度89.7％)和格列本脲(纯度99.5％)均购于中国食品药品检定研究院。乙腈(色谱纯，Fisherscientific)。甲酸(色谱纯，Sigma-Aldrich)。水，AdvantageA10Milli-Q超纯水机制备的超纯水。2对照品溶液配制2.1叶酸标准溶液配制精密称取叶酸10mg，置10ml量瓶中，加5ml二甲亚砜超声溶解，然后用乙腈定容至刻度，配制1mg/ml的储备液，然后取叶酸1ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得100μg/ml的对照品溶液(I)，然后加乙腈稀释成系列对照品储备液，见表1。表1叶酸标准溶液配制2.2格列本脲溶液配制精密称取10mg格列苯脲置10ml量瓶中，乙腈超声溶解并定容至刻度，配成浓度为1mg/ml的储备液，然后取0.5ml置10ml量瓶中，加乙腈定容至刻度得50μg/ml的内标溶液，最后取50μg/ml内标溶液250μl置250ml量瓶中，加乙腈定容至刻度，得50ng/ml的内标工作溶液。3样本处理方法血浆样本解冻后取30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测。4实验动物SD大鼠6只，体重180～220g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，在温度25℃、湿度60％±5％条件下饲养一周后灌胃给药叶酸溶液，叶酸给药剂量为每1kg大鼠给药2.4mg。分别于给药前，给药结束0.5、1、2、4、6、8、24h颈静脉取血0.2ml，置1.5ml涂肝素钠的尖底离心管中，在4℃下4000r/min离心10min，取上层血浆-20℃冰箱中保存备用。5方法学验证5.1HPLC-MS/MS条件色谱条件：液相采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法，其特征在于，包括步骤(1)样品制备，(2)采用液相色谱‑质谱联用检测，(3)标准曲线制备，(4)大鼠血浆中叶酸浓度测定；所述步骤(1)样品制备的步骤包括：取待测血浆样本，加入内标工作溶液沉淀蛋白，混匀后加超纯水混匀，低温离心，取上清液；所述内标溶液中内标为格列本脲；所述步骤(2)采用液相色谱‑质谱联用检测的步骤包括：(a)液相色谱条件液相采用Agilent 1260高效液相，色谱柱：C18柱；流动相：0.1％甲酸‑水(A)与乙腈(B)；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱梯度程序如下：0～0.5min，5％(v/v)B；2.2～3.2min，95％(v/v)B；3.21～6min，5％(v/v)B；(b)质谱条件质谱采用Agilent 6430三重四极杆质谱仪，电喷雾正离子源，多反应监测分析模式(MRM)；所述(a)液相色谱条件中，色谱柱为Thermo Accucore C18柱(50mm×2.1mm，2.6μm)，样品检测时间：6min；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：40℃；所述(b)质谱条件中，干燥气：N

【技术特征摘要】
1.一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法，其特征在于，包括步骤(1)样品制备，(2)采用液相色谱-质谱联用检测，(3)标准曲线制备，(4)大鼠血浆中叶酸浓度测定；所述步骤(1)样品制备的步骤包括：取待测血浆样本，加入内标工作溶液沉淀蛋白，混匀后加超纯水混匀，低温离心，取上清液；所述内标溶液中内标为格列本脲；所述步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：(a)液相色谱条件液相采用Agilent1260高效液相，色谱柱：C18柱；流动相：0.1％甲酸-水(A)与乙腈(B)；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱梯度程序如下：0～0.5min，5％(v/v)B；2.2～3.2min，95％(v/v)B；3.21～6min，5％(v/v)B；(b)质谱条件质谱采用Agilent6430三重四极杆质谱仪，电喷雾正离子源，多反应监测分析模式(MRM)；所述(a)液相色谱条件中，色谱柱为ThermoAccucoreC18柱(50mm×2.1mm，2.6μm)，样品检测时间：6min；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：40℃；所述(b)质谱条件中，干燥气：N2；干燥气流速：10L/min，干燥气压力：40psi，干燥气温度：350℃，毛细管电压：4000V。MRM监测方法参数如下：定量离子对叶酸：[M...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚敏，王本伟，王功霞，王芳，徐玲玲，贾庆文，马玉奎，刘爱明，逯海燕，刘琳，
申请(专利权)人：山东省药学科学院，
类型：发明
国别省市：山东,37