本发明专利技术涉及一种同时测定四逆剂植物药血浆中5种生物碱的方法。包括：（1）取哺乳类动物给予四逆剂植物药的含药血浆，加入草乌甲素（内标），氨水碱化，涡旋，加入乙酸乙酯萃取，涡漩，离心，下层液再用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，氮气吹干，残渣用流动相溶解;（2）HPLC-MS-MS测定：流动相：A相为乙腈-0.1%冰醋酸（1:99，v/v），B相为乙腈-水（99:1,?v/v）；质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式检测；检测离子：乌头碱m/z?646.3→586.3；新乌头碱m/z?632.3→572.3；次乌头碱m/z?616.3→556.3；苯甲酰新乌头原碱m/z?590.3→558.3；苯甲酰乌头原碱m/z?604.3→554.3。本发明专利技术适用于四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱在哺乳动物体内的药代动力学研究。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及。包括：（1）取哺乳类动物给予四逆剂植物药的含药血浆，加入草乌甲素（内标），氨水碱化，涡旋，加入乙酸乙酯萃取，涡漩，离心，下层液再用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，氮气吹干，残渣用流动相溶解;（2）HPLC-MS-MS测定：流动相：A相为乙腈-0.1%冰醋酸（1:99，v/v），B相为乙腈-水（99:1,?v/v）；质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式检测；检测离子：乌头碱m/z?646.3→586.3；新乌头碱m/z?632.3→572.3；次乌头碱m/z?616.3→556.3；苯甲酰新乌头原碱m/z?590.3→558.3；苯甲酰乌头原碱m/z?604.3→554.3。本专利技术适用于四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱在哺乳动物体内的药代动力学研究。【专利说明】—种同时测定四逆剂植物药血浆中5种生物碱的方法
本专利技术属药物代谢动力学领域，特别是涉及四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱在哺乳动物血浆中的测定方法。
技术介绍
四逆汤由附子、干姜、炙甘草等药物组成，在保护心肌、改善心功能、防止缺血-再灌注的损伤等方面均具有较好的防治作用，但对四逆汤植物药缺乏药物代谢动力学的研究，难以为质量控制、剂型设计、临床合理用药提供依据。四逆汤中的药效成分主要为附子中的生物碱类成分。附子中生物碱类成分主要可以分为双脂型生物碱、单脂型生物碱和胺基醇类生物碱。其中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等为双脂型二萜类生物碱，单脂型生物碱如苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱是双脂型生物碱的水解产物，其毒性仅约为乌头碱的千分之一，进一步水解为胺基醇类生物碱毒性更低，但其药效却未有明显降低.乌头类生物碱研究进展与应用前景评述.中国中医药信息杂志2004，11 (10):922-923]。到目前为止，文献仅有 对血浆样品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双脂型二萜类生物碱的测定方法.中国药科大学学报，2010,41(1): 55- 59;沈红，朱玲英，姚楠，等.甘草与附子配伍对乌头碱新乌头碱、次乌头碱大鼠药动学的影响.中药材，2011，34(6):937-942]，尚未见四逆剂植物药血浆样品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定方法，该方法用于药代动力学研究，阐明四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的药代动力学规律。( I)哺乳类血浆样品预处理 取哺乳类动物给予四逆剂植物药的含药血浆100μ L，加入草乌甲素(内标)10 UL (10ng.ml/1),氨水10 μ L碱化,润旋30s,按照1:4- 1:10体积比加入乙酸乙酯,润镟3-5 min,离心10 min (4000-10000 r ^mirT1),取上清液，下层液再用1:4体积比乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，氮气吹干，残渣用流动相100 yL溶解。(2 ) HPLC-MS-MS 测定 色谱条件:色谱柱:CAPCELL PAK C18 (100 mmX4.6 mm, 5 ym),流动相:A相为乙腈-0.1%冰醋酸(1:99，v/v)，B相为乙腈-水(99:1，v/v);质谱条件:电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测，检测离子:乌头碱+，m/z 646.3 — 586.3，dp:120V，CE:47V ;新乌头碱+, m/z 632.3 — 572.3,642.3 — 640.3，dp:120V，CE:45V ;次乌头碱+, m/z 616.3 — 556.3,616.3 — 524.3，dp:120V，CE:47V ;苯甲酰新乌头原碱M+H]+, m/z 590.3 — 558.3,590.3 — 540.3，dp:120V，CE:47V ;苯甲酰乌头原碱 M+H]+，m/z 604.3 — 554.3,604.3 — 572.3，dp:120V，CE:50V。所述四逆剂包括附子干姜汤、四逆汤及其制剂；所述步骤(1)采用草乌甲素为内标物；所述步骤(2)采用正离子模式检测。本专利技术在液液萃取中，被检测组分在不相混溶的两种溶剂中分配，选择合适的有机溶剂及合适的比例，可使溶于血浆中的非极性组分提取进入有机相，再将有机相用氮气吹干富集。利用HPLC法将被检测组分与其他化学成分分离，最后联用MS检测器进行检测。本专利技术采用草乌甲素作为内标，使分析方法更加灵敏、准确，有利于四逆汤植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定。【专利附图】【附图说明】图1四逆汤植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱HPLC-MS-MS色谱图。【具体实施方式】下面将结合具体实验例及实施例，进一步阐述本专利技术方法。应理解，这些实验例及实施例仅用于说明本专利技术而不 用于限制本专利技术的范围。此外，应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或者修改，这些等价形式同样落后于本申请所附权利要求书所限定的范围。实验例I非内标法线性关系考察取空白血浆7份，每份ΙΟΟμ 1，加入不同浓度的标准品溶液，使血浆中的乌头碱浓度为0.06,0.6、3、6、30、60、300 ng.πι?Λ 新乌头碱浓度为 0.102,1.02,5.1,10.2、51、102、510ng ^mL4,次乌头碱 0.13、1.3、6.5、13、65、130、650 ng ^mL4,苯甲酰新乌头碱浓度为 0.1、1、5、10、50、100、500 ng.mL'苯甲酰乌头原碱浓度为 0.12、1.2、6、12、60、120、600 ng.πι?Λ制得系列标准溶液。以各对照品的浓度为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，采用加权最小二乘法回归(权重系数1/C)，得到各对照品的回归方程。回归曲线结果表明:乌头碱在0.06-300 ng.mL-1浓度范围内线性关系良好:y = 0.486 x -1.68 (r =0.9765);苯甲酰乌头原碱在0.12-600 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y = 0.1472x-1.45 (r = 0.9638);苯甲酰新乌头碱在0.1-1000 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y=0.324 X -0.654 (r = 0.9754);次乌头碱在0.13-650 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y = 1.09 X -8.63 (r = 0.9658);新乌头碱在0.102-500 ng.ml/1浓度范围内线性关系良好:y = 0.389 X -1.86 (r = 0.9542)。实验例2内标法线性关系考察取空白血浆7份，每份?οομ 1，加入不同浓度的标准品溶液，使血浆中的乌头碱浓度为0.06,0.6、3、6、30、60、300 ng.πι?Λ 新乌头碱浓度为 0.102,1.02,5.1,10.2、51、102、510ng ^mL4,次乌头碱 0.13、1.3、6.5、13、65、130、6本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时测定四逆剂植物药血浆中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的方法，包括下列步骤：（1）哺乳类血浆样品预处理将哺乳类给予四逆剂植物药的含药血浆，加入内标物，氨水碱化，涡旋30s，按照1:4?1:10体积比加入乙酸乙酯，涡漩3?5?min，离心10?min，转速为4000?10000?r·min?1，移出上清液，下层液再用1:4体积比乙酸乙酯同样操作2次，合并3次上清液，氮气吹干，残渣用流动相100?μL溶解；（2）HPLC?MS?MS测定色谱条件：色谱柱：?C18，100?mm×4.6?mm，5?μm，流动相：A相为乙腈?0.1%冰醋酸（1:99，v/v），B相为乙腈?水（99:1,?v/v）；质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：洪燕龙，冯怡，阮克锋，赵怀彬，吴飞，王优杰，
申请(专利权)人：上海张江中药现代制剂技术工程研究中心，
类型：发明
国别省市：
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