一种测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，本发明专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，适合于测定血浆或尿液中D-山梨醇的浓度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种药物分析技术，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法。
技术介绍
肝功能性血流量是指流经肝血窦并发挥功能的那部分肝血流，目前只有通过清除率的方法来测定。在临床上，D-山梨醇清除率可反映肝总血流量，其改变能可靠的反映肝血流量的变化，从而反映肝储备功能。所以，D-山梨醇肝清除率是肝硬化疾病治疗中选择治疗方式、评价的治疗效果的可靠指标。通过测定D-山梨醇的血浆浓度和尿液浓度可以计算山梨醇的整体清除率和肾清除率，由于山梨醇无肝、肾外清除(以肝清除为主)，故山梨醇肝的清除率即为整体清除率与肾清除率之差。目前关于生物样本中D-山梨醇的测定方法，主要为酶分光光度法，这种方法存在灵敏度低、定量不准确、操作繁琐等缺陷。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的在于提供一种测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法。技术方案本专利技术的目的是通过如下的方案实现的一种测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法，采用液质联用系统测定，包括以下步骤(I)血浆或尿液样品预处理；(2) D-山梨醇进行液相色谱分离；(3)质谱测定；(4)计笪上述测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法，步骤(I)血浆或尿液样品预处理取给予过D-山梨醇的犬或人的血浆或尿液样品，加入定量的甲醇或乙腈蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀；步骤(2) D-山梨醇进行液相色谱分离色谱条件中色谱柱为汉邦Lichrospher NH2柱；流动相体积比为70 30的甲醇-水溶液；流速0. 6-1. OmL ^irT1,分流比I : 3 ;柱温30-40°C ;洗脱方式为等度洗脱；步骤(3)质谱测定，条件为离子源电喷雾离子化电离源ESI ;离子检测方式选择性离子检测SM ;离子极性负离子；毛细管电压3. OKV ;离子源温度80-120°C ;脱溶剂温度340-36(TC ;脱溶剂气380L/h ;锥孔气30L/h ;脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子选择通道D-山梨醇，-，m/z 180. 9, Dwell 0. 2, Cone 30;内标替硝唑，-, m/z 246. 0, Dwell 0. 2, Cone 30;步骤⑷计算采用内标法，以D-山梨醇和内标替硝唑的峰面积比值代入标准曲线方程计算D-山梨醇浓度。上述测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法，步骤(2) D-山梨醇进行液相色谱分离色谱条件中色谱柱为汉邦Lichrospher NH2柱；流动相体积比为70 30的甲醇-水溶液；流速0. 8mL mirT1，分流比I : 3 ;柱温35°C ;洗脱方式为等度洗脱；步骤(3)质谱测定，条件为离子源电喷雾离子化电离源ESI ;离子检测方式选择性离子检测SIM ;离子极性负离子；毛细管电压3. OKV ;离子源温度10(TC ;脱溶剂温度350°C ;脱溶剂气380L/h ;锥孔气30L/h ;脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子选择通道=D-山梨醇，-, m/z 180. 9，Dwell 0. 2，Cone 30 ;内标替硝唑，-, m/z 246. 0, Dwell 0. 2, Cone 30。上述测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法，步骤⑴中，血浆样品取血浆100 Ii L,加入900 V- L甲醇沉淀，振荡lmin, 12000rpm离心IOmin,取上清50 u L,加入50 u L甲醇、400 u L浓度为2. 174ug* mL—1的替硝唑甲醇内标溶液，混匀；尿样品取尿液10 u L，加入甲醇990 y L，振荡lmin，12000rpm离心lOmin，取上清50 y L，加入950 y L浓度为2.174ug* mL—1的替硝唑甲醇内标溶液，混匀。上述测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法，步骤(2)中色谱条件中色谱柱长度为250mm,内径为4. 6mm,粒径为5 y m。上述测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法，步骤(I)中D-山梨醇给予和血浆或尿液样品取样方法为静脉持续滴注5% D-山梨醇溶液3h,给药量为150mg kg_S于滴注后3h采集外周静脉血3ml，注入肝素管内，制备血浆或收集滴注后3h内尿液，计量、备测。上述测定血浆或尿液中D-山梨醇浓度的方法，所述血浆或尿液为犬或人的血浆或尿液。有益效果(I)预处理方法简便一步有机溶媒蛋白沉淀法，适用于常规测定。(2)专属性强采用Lichrospher NH2色谱柱作为固定相，甲醇和水的混合液作为流动相，等度洗脱，D-山梨醇保留时间为4. 83min左右，内标替硝唑保留时间为4. 13min左右，6. 5分钟完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。(3)灵敏度高血浆最低定量限为I. 25 yg 尿液最低定量限为0. 125ug. mL' (4)本专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为山梨醇的临床血尿药物浓度测定提供依据，具有临床应用的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为I. 25 125ii g mL—1，尿液标准曲线线性范围为0. 125 12. g mL—1，日内和日间精密度RSD均小于5%。附图说明图I为犬空白血浆的质谱2为犬空白血浆加入标准品后的质谱3为犬给予D-山梨醇后血浆样品的质谱4为甲醇的质谱5为甲醇加入标准品的质谱6为犬给予D-山梨醇后尿样品的质谱图注图中离子选择通道I为D-山梨醇，-，m/z 180. 9，保留时间为4. 83min左右；离子选择通道2为内标替硝唑，-, m/z 246. 0，保留时间为4. 13min左右。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例I :犬血浆中D-山梨醇浓度的测定一、实验材料与仪器D-山梨醇对照品 购于中国药品生物制品检定所；批号100555-200306替硝唑对照品(内标)购于中国药品生物制品检定所；批号100336-200402试验用水超纯水；甲醇色谱纯(Merck Company)。ZQ2000LC/MS液质联用仪(美国Waters公司，所配高效液相仪为Waters 2695)；Masslynx 4. 0数据处理系统；WH_2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Millipore Drict_Q5纯水机(法国Millipore公司);Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司)。二、液质条件I.液相色谱条件色谱柱汉邦LichrospherNH2 柱(dp 5mm, 250mm ID X 4. 6mm);流动相甲醇-水溶液(70 30, v/v);流速0. SmLiirT1 (分流比 I 3);柱温35°C。2.质谱条件离子源电喷雾离子化电离源ESI ;离子检测方式选择性离子检测SIM ;离子极性负离子；毛细管电压3. OKV ;离子源温度100°C ;脱溶剂温度350°C ;脱溶剂气380L/h ;锥孔气30L/h ;脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子选择通道D-山梨醇，-, m/z 180. 9, Dwell 0. 2，Cone 30;内标替硝唑，-, m/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许美娟，储继红，刘史佳，居文政，张军，吴婷，李长印，
申请(专利权)人：江苏省中医院，
类型：发明
国别省市：