本发明专利技术涉及原花青素的应用及含原花青素的凝血酶时间测定试剂，原花青素对凝血酶时间测定试剂起稳定作用，用量为0.5-2％。凝血酶时间测定试剂组分包括凝血酶5-100U/mL和稳定剂原花青素0.5-2％，稳定剂还可以含有甘氨酸2-3％、氯化钙8-110mM、聚乙二醇0.05-0.5％、甘露醇2-3％、麦芽糖1-2％、山梨酸钾0.5-1％，其中的百分比均为质量体积百分比。本发明专利技术组成的试剂，可用于凝血酶时间的测定。结果表明，在含有凝血酶的试剂中，添加原花青素，不会抑制凝血酶的酰胺反应和蛋白反应，同时能改善试剂的稳定性。凝血酶在液相环境中稳定性的改善，与原花青素对抗活性氧较强的消除能力、对影响凝血酶稳定性的二价金属离子的螯合效应以及抗菌性能有关。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及原花青素在凝血酶试剂中的应用，以及一种含有原花青素稳定剂的凝 血酶时间测定试剂及其制备方法。
技术介绍
用于测定凝血酶时间（TT)的试剂，其中的活性组份为凝血酶。凝血酶是 一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶（CrawleyJT，The centralroleofthrombininhemostasis.JThrombosisHaemostasis2007,5(suppl 1):95 - 101；McMichaelM. ,Newmodelsofhemostasis.TopicsinCompanionAnimal Medicine，2012, 27:40 - 45)。作为活性凝血因子II，它的活性受很多因素的影响，特别 是在液相或乳浊相中。为了维系凝血酶的活性，可添加低浓度的盐类和醇类（USPatent 4696812) ;BSA和EDTA(USPatent4409334);氨基酸类和有机酸及多糖类（特願平 11/272092卜口 >匕、y?安定化手段朽Ar/組成物；USPatent20060246052A1)。含有上 述稳定剂的液相凝血酶制剂，经冷冻干燥制成粉剂后，凝血酶的活性得到较好的保护。另一 方面，根据实验研究，上述添加剂对液态或乳浊相中的凝血酶的稳定效果并不尽理想，特别 是在试剂存放较长时间的条件下。这是由于液态状态下，凝血酶的结构相对粉末态比较脆 弱，酸、碱、温度、离子强度以及其它某些化合物（包括重价金属离子）的少量存在，都会引 起凝血酶空间结构的改变，局部结构的微小变化也会引起凝血酶活性的丧失。作为多酷类，黄酮可用于抗菌（Cushnie，T.，Lamb，A.Antimicrobialactivity offlavonoids.InternationalJournalofAntimicrobialAgents2005, 26, 343-356)， 以及抑制肿瘤生长（Ferguson，P.J.，Kurowska，E.M.，Freeman，D.J.Invivoinhibition ofgrowthofhumantumorlinesbyflavonoidfractionsfromcranberry extract，NutritionandCancer2006, 56, 8694)，而更多的研究则倾向于它的抗氧 化性 能(VanAcker,S.A.B.E. ,Structuralaspectsofantioxidantactivityof flavonoids,FreeRadicalBiologyandMedicine1996,20,331-342.；DeSouza,R. F.,Antioxidantpropertiesofcomplexesofflavonoidswithmetalions,Redox Report2004, 9, 97 - 104.；TeixeiraS. ,Structure-propertystudiesonthe antioxidantactivityofflavonoidspresentindiet.FreeRadicalBiologyand Medicine2005,39, 1099-1108)。 有研究表明，在含有凝血酶的体系中加入黄酮，凝血酶的活性会受到抑制（Hugo A.Guglielmone,Anticoagulanteffectandactionmechanismofsulphatedflavonoids fromFlaveriabidentis，ThrombosisResearch，2002,2 :183 - 188;LiuL，MaH，Yang N，Aseriesofnaturalflavonoidsasthrombininhibitors:structure-activity relationships.ThrombosisResearsh，2010, 126:365 - 378)D 但是，黄酮包含多个亚类，它 具有较好的抗氧化性，也具有很强的金属离子螯合能力，从而可以降低二价金属离子对物 相氧化反应的催化作用（VanAcker，Influenceofironchelationontheantioxidant activityofflavonoids.Biochem.Pharmacol. 1998, 56:935-943)。基于上述思路，我们发 现并不是所有的黄酮都能够抑制凝血酶的活性，而属于黄酮类的原花青素，不仅不会影响 凝血酶的酰胺反应和蛋白反应，同时还会提升含有凝血酶的液相体系的稳定性能。 原花青素主要分布在植物中，包括银杏、大黄、山楂、耳叶番泻、小连翘、葡萄、日本 罗汉柏、北美崖柏、花旗松、白桦树、野生豪4葵、番荔枝、野草莓、海岸松、洋委陵菜、甘薯 等，其中，葡萄籽与松树皮提取物中原花青素的含量最高。 原花青素在结构上由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的原花青素 是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体、三聚体、四聚体至十聚体。原花 青素含有很多酚羟基，溶解度较银杏黄酮高，特别是低聚体的溶解性特别好。原花青素为 白色粉末，溶于水、乙醇、甲醇、丙酮，也可溶于乙酸乙脂。它在280nm有强吸收。原花青素 有较强的抗氧化活性，对活性氧有很强的消除能力（KotaT,IncreaseofAntioxidative PotentialofRatPlasmabyOralAdministrationofProanthocyanidin-RichExtract fromGrapeSeeds(J)AgriculturalandFoodChemistry, 1999,45 (5):1892_1897)，摄 入原花青素可提高血浆对氧化应激的抵抗力。同时，酚类消除自由基的能力与化学性 质和立体结构密切相关（SaintCricq,PolyphenolprofilesofFreeheiderapple varieties,JournalofAgriculturalandFoodChemistry, 1999,47(12):4847-4853)〇 本专利技术在实验研究的基础上，发现在含有凝血酶的试剂中，添加原花青素，可以制 备出较好稳定性的凝血酶时间测定液态试剂。
技术实现思路
本专利技术以原花青素为主要研究对象，分析了原花青素对凝血酶蛋白反应的影响， 提出在含有凝血酶的试剂中，添加原花青素，可以提升凝血酶试剂的稳定性。所得到的含有 凝血酶的试剂，可用于测试凝血酶时间。 具体地，本专利技术采用原花青素用于稳定液相蛋白质，特别用于稳定含有凝血酶的 诊断试剂。 所述的原花青素，用于稳定凝血酶时间测定试剂时，所述原花青素的加入量为质 量体积比0. 5-2%，最佳加入量为质量体积比1. 5%。 所述的原花青素，当用于凝血酶时间测定试剂中时，不会降低凝血酶的酰胺活性 和蛋白活性，同时会稳定含有凝血酶的乳浊相。 -种凝血酶时间测定试剂，包含凝血酶5-100U/mL、稳定剂原花青素0. 5-2%。 所述的凝血酶时间测定试剂，组分中还可以含有其它稳定剂，包括甘氨酸、氯化 钙、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖、山梨酸钾中的一种或几种。所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
原花青素的应用，其特征在于，应用于凝血酶时间测定试剂中，起到稳定剂作用，所述原花青素的加入量为质量体积比0.5‑2％。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡小伟，黄翔宇，王华，高军，
申请(专利权)人：青岛古高生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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