一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种药物含量的测定方法，特别涉及一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。本发明专利技术所述的方法，包括以下步骤：1）对照品储备液的制备：称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液。2）内标溶液的制备：取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液。3）血浆样品处理方法：取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙酸乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液。4）含量测定：采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度。

【技术实现步骤摘要】

： 本专利技术涉及一种药物含量的测定方法，特别涉及一种测定人血浆中丹参素，间位 甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。
技术介绍
： 复方丹参滴丸为天士力公司开发的活血化瘀、理气止痛中药，用于胸中憋闷、心绞 痛，其主要成分为丹参、三七、冰片，其药理作用包括1增加冠脉血流量，2增加心肌耐缺氧 保护缺血心肌,3抗血小板聚集防止血栓形成，4改善微循环。 复方丹参滴丸中丹参味苦，性微寒，具有活血化瘀，养血安神，凉血排痈和排毒生 肌的功效，是中药活血化瘀的常用药物。丹参药材主含脂溶性的二萜类成分和水溶性的酚 酸类成分，尚含有黄酮类、三萜类、留醇等其他成分。二萜类成分中属醌、酮型结构的有丹参 酮I、IIA、IIK、V、VI，隐丹参酮，异丹参酮I、II、IIB，二氢丹参酮I等。水溶性的酚酸类成 分有丹参素，原儿茶醛，咖啡酸及丹参素与咖啡酸的衍生物或二聚物酯化而成的缩酚酸。 丹参素、原儿茶醛是复方丹参滴丸的主要成分，近年来，有关生物样品中丹参素、 原儿茶醛、原儿茶酸的含量测定方法（如HPLC、LC-MS/MS等）有较多报道，但大多为上述化 合物单独测定的方法。据文献报道，丹参素、原儿茶醛在人体会分别代谢生成间位丹参素和 原儿茶酸。 中药药物代谢动力学是应用动力学原理，研究中药活性成分、组分、单味药和复方 体内吸收、分布、代谢、排泄和毒性的动态变化规律及其体内时-量、时-效关系，并用数学 函数加以定量描述的一门新兴学科。开展中药药物代谢动力学研究对阐明和揭示中药药 效物质基础和作用机制，设计及优选中药给药方案，促进中药新药研发、剂型改进及质量控 制，均具有重要意义。目前中药药动学研究方法归纳起来可分为两大类，一类是针对成分明 确的中药及复方，即血药浓度法；另一类是化学基础研究薄弱成分尚不明确的中药及复方， 该类主要以生物效应法为研究手段，包括药理效应法、药物累积法、效量半衰期法、微生物 法等。液相色谱质谱法是最近十几年来发展起来的一种新的分离分析方法，由于其高选择 性和高灵敏度已成为药代动力学研究的一种较理想的检测方法。 为深入研究复方丹参滴丸主要成分在人体内的吸收及代谢过程，需要建立一种丹 参素、原儿茶醛及其代谢产物同时测定的方法。 本专利技术经过研究找到一种丹参素、原儿茶醛、间位丹参素和原儿茶酸人血浆中联 测的LC-MS/MS方法，本方法具有专属性强、灵敏度高、准确性和重现性好等优点，满足人体 药代动力学要求。
技术实现思路
： 人在服用含有丹参的药物，如复方丹参滴丸后，经过吸收和代谢，血浆中含有丹参 素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸。为检测服用复方丹参滴丸后人体血浆中上述成 分的含量本专利技术提供了一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸 的方法，所述方法，包括以下步骤： 1)对照品储备液的制备 称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹 参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液。 2)内标溶液的制备 取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液。 3)血浆样品处理方法 取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙酸 乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液。 4)含量测定 采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到 色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在 血浆中的浓度。 优选的，所述方法，包括以下步骤： 1)对照品储备液的制备 分别称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，分别用甲醇配成 浓度为150-250i!g/ml的对照品储备液I。 分别取4种对照品储备液I，分别用40-60% (V/V)甲醇水溶液配制浓度均为 2-6yg/ml的各自的对照品储备液II。 2)内标溶液的制备 称取内标物香草酸用甲醇配制成150-250yg/ml的内标储备液，进一步用甲醇配 制成3-7iig/ml的香草酸内标溶液。 3)血浆样品处理方法 取血浆样品150-250iil，依次加入内标溶液30-70iil，40-60% (V/V)甲醇水溶液 30-70yl，0. 5-2mol/L的盐酸溶液10-30yl，涡旋均匀，加入0. 5-2ml乙酸乙酯，涡旋振荡 20-40s，离心，取上清乙酸乙酯层500-1200iil，用氮气流吹干，用100-150iil40-60% (V/V) 甲醇水溶液复溶，离心，得血浆样品上清液。 4)含量测定 采用LC-MS/MS色谱法，将上述各自的对照品储备液II和血浆样品上清液注入色 谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和 原儿茶酸在血浆中的浓度。 最优选的，所述方法，包括以下步骤： 1)对照品储备液的制备 分别精密称取丹参素对照品、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品各 10.Omg分别置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得丹参素、间位甲基丹参 素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为200g/ml的对照品储备液I。精密量取200ill各自对照品储备液I，分别用50%甲醇水溶液定容至10ml，即得 丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为4yg/ml的各自的对照品储备液 II。 2)内标溶液的制备 精密量取内标物香草酸10.Omg置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇 匀，即得200yg/ml的内标储备液，精密量取此内标储备液125ill置于5ml容量瓶中，用甲 醇溶解并稀释至刻度，即得5yg/ml的内标溶液。 3)血浆样品处理方法取血浆样品200ill，依次加入内标溶液50ill，50%甲醇水溶液50ill，lmol/L的盐 酸溶液20iU，涡旋均匀，加入lml乙酸乙酯，涡旋振荡30s，15000rpm离心lmin，取上清乙 酸乙酯层900iil，40°C下氮气流吹干，用120iU50%甲醇水溶液复溶，15000rpm离心3min， 得血浆样品上清液。 4)含量测定 采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪，得 到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸 在血浆中的浓度。 其中所述LC-MS/MS色谱法，色谱条件如下：色谱柱：C18 柱(优选：DikmaDiamonsilC18 柱，50X2.lmm, 5ym);预柱：菲罗门公 司预柱（型号：KJ0_4282);流动相：A相为0. 1%的甲酸水溶液和B相为含0. 1%甲酸的甲 醇，进行梯度洗脱：〇_〇? 5minl% ~4%(优选 2%) (B)，0? 5-4. 5minl% ~4% 至 75% ~95% (优 选 2% 至 85%) (B)，4. 51-5min75% ~95% 至 95% (优选 85% 至 95%) (B)，5. 01-6. 5min75% ~ 95% 至 1% ~4% (优选 95% ~2%) (B);流速：0? 2 ~0? 5ml/min(优选：0? 35ml/min);柱温： 15~35°C(优选：25°C);进样器温度：2~10°C(优选：4°C)。 质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法，其特征在于，所述方法，包括以下步骤：1）对照品储备液的制备称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液；2）内标溶液的制备取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液；3）血浆样品处理方法取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸或三氯乙酸或高氯酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙酸乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液；4）含量测定采用LC‑MS/MS色谱法，将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度，其中所述LC‑MS/MS色谱法，色谱条件如下：色谱柱：C18柱；预柱；C18柱，流动相：A相为0.1‑0.5%的酸水溶液和B相为含0.1‑0.5%酸的甲醇，进行梯度洗脱：0‑0.5min  1%～4%(B)，0.5‑4.5min 1%～4%至75%～95%(B)，4.51‑5min 75%～95%至95%(B)，5.01‑6.5min 75%～95%至1%～4%(B)；流速：0.2～0.5ml/min；柱温：15～35℃；进样器温度：2～10℃；质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式，选择多反应监测模式(MRM)进行二级质谱分析，相关质谱参数如下：Collision Gas：Medium；IonSpray Voltage：–3000～–5500V；Temperature：400～700℃；Curtain Gas：10.0～40.0；Ion Source Gas1：40.0～80.0；Ion Source Gas2：35.0～75.0。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，罗瑞芝，褚扬，杨柳，马晓慧，郭治昕，周水平，孙鹤，
申请(专利权)人：天士力制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12