一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法，属于生物检测技术领域。本实验以硝基安定为内标，蛋白沉淀法预处理后，采用高效液相色谱-串联质谱法可同时检测3种化合物的血药浓度。本发明专利技术方法时间短、特异性强、灵敏度高、操作简便，已成功运用于人血浆中奥卡西平及其代谢产物的分析研究。

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法
本专利技术涉及一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法，属于生物检测

技术介绍
癫痫(Epilepsy)是一种世界范围内常见的神经系统疾病，其临床特征为脑神经细胞反复发作的异常放电引起的大脑功能失调，因其病程长，致残率高，成为儿科神经系统中发病率最高、危害最为严重的疾病。如不能很好的控制，将会对脑神经造成不可逆的损伤，严重影响儿童的生长发育，给患儿、家庭和社会带来沉重的心理负担和经济压力。奥卡西平(Oxcarbazepine，OXC)是一种新型的治疗癫痫局部发作和全身强直阵挛性发作的药物。奥卡西平(OXC)进入机体后，肝细胞溶质酶(AKR1C1,AKR1C2,AKR1C3,AKR1C4，CBR1和CBR3)能够迅速将其转化为活性代谢物10,11-二氢,10-羟基卡马西平(MHD)，并发挥药理作用，MHD在UGT催化下又进一步与葡萄糖醛酸结合排出体外，小部分MHD被氧化成无药理活性的10,11-二羟基卡马西平(DHD)，90％以上的药物以代谢产物形式通过尿液排出：葡萄糖醛酸结合物(49％)、MHD(27％)、DHD(3％)、其他代谢产物(13％)，OXC少于1％；不到4％原药从粪便中排出。由此可见，代谢是OXC体内消除的主要形式，MHD与UGT的Ⅱ相结合反应，是OXC在体内进行生物转化最重要的途径，影响UGT活性将会干扰MHD体内代谢，从而改变MHD血药浓度，导致治疗失败甚至引发严重不良反应，将对患者用药安全造成极大危害。高效液相-串联质谱法(HPLC-MS/MS)是检测药物浓度最常用的方法，具有灵敏度高、特异性强等特点，可以对多种微量化合物同时进行检测。因此，通过同时检测人体内OXC、MHD、MHD-G的血药浓度，可以更加准确的监测OXC在体内动态的代谢变化情况，以及判断是否由于OXC代谢减少或UGT基因突变导致MHD治疗药物浓度的降低。目前，经过系统验证的HPLC-MS/MS方法只能同时检测OXC和MHD，但也具有缺陷：如走样时间较长(10min)(High-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometrymethodforsimultaneousquantificationofcarbamazepine,oxcarbazepine,andtheirmainmetabolitesinhumanserum.TherDrugMonit.2012，34(1):53-58)、处理方法复杂(提取法)(Simultaneousquantitativeanalysisofoxcarbazepineand10,11-dihydro-10-hydroxycarbamazepineinhumanplasmabyliquidchromatography-electrospraytandemmassspectrometry.JPharmBiomedAnal.2007，45(2):304-311)。对于MHD-G的检测方法未查到相关文献，也未见同时检测OXC、MHD、MHD-G的文献报道，本专利技术首次建立了OXC、MHD、MHD-G人血浆内的HPLC-MS/MS测定方法，为OXC的临床血药浓度的检测奠定了坚实的方法学基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足之处，提供一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法。按照本专利技术提供的技术方案，一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法，步骤为：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标硝基安定，再加入乙腈沉淀蛋白，速度离心取上清液，得到预处理后的血浆样品；(2)色谱：将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱：PhenomenexkinetexXB-C18柱；流动相：乙腈:水体积比为50:50，水中含有质量浓度为0.1％的甲酸；流速：250～300μL/min；柱温：30～40℃；进样量：10μL；(3)质谱：离子源：电喷雾离子化ESI离子源，方式扫描：选择反应检测扫描SRM，喷雾电压：3500～4000V，鞘气：20～50psi，辅助气：10～20arb，毛细管温度：350℃，离子源温度：300℃；(4)计算：采用内标法，以OXC、MHD、MHD-G和内标硝基安定的峰面积比值代入标准曲线方程，计算OXC、MHD、MHD-G的血药浓度。步骤(1)具体为：取血浆样品150μL，加入1000ng/mL内标硝基安定溶液15μL，再加入乙腈285μL，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，离心后取上清液。步骤(1)所述血浆样品为含OXC、MHD、MHD-G的血浆。步骤(2)中色谱柱长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为2.6μm。步骤(3)中检测离子具体如下：OXC选择性反应检测离子[M+H]+m/z253.2→m/z180.2CE:28eV；MHD选择性反应检测离子[M+H]+m/z255.2→m/z194.2CE:21eV；MHD-G选择性反应检测离子[M+H]+m/z431.1→m/z194.2CE:28eV；内标硝基安定选择性反应检测离子[M+H]+m/z282.3→m/z236.2CE:22eV。本专利技术的有益效果：(1)预处理方法简便：采用一步蛋白沉淀法，适用于常规检测。(2)专属性强，采用PhenomenexkinetexXB-C18色谱柱进行分离，乙腈:水(水中含有质量浓度为0.1％的甲酸)的混合液作为流动相，等度洗脱，OXC的保留时间约为1.24min，MHD的保留时间约为1.07min，MHD-G保留时间约为1.00min，内标硝基安定(Nitrazepam)的保留时间约为1.55min，四者具有良好的分离度，可在3min内完成测定。此外，内源性物质不干扰两者的测定。(3)灵敏度高：血浆中OXC、MHD、MHD-G最低定量限为10、50、125ng/mL。(4)检测快速：3min完成样品的一次测定，时间短，因此适合大批量的生物样品的检测。(5)样品用量小：仅需150μL血浆样品，即可测定出准确浓度。(6)本专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为OXC、MHD、MHD-G的血药浓度测定提供依据。本方法的OXC、MHD、MHD-G血浆标准曲线线性范围为10～750ng/mL、50～10000ng/mL、125～5000ng/mL，低QC日内、日间精密度和准确度均小于20％；中、高QC日内、日间精密度和准确度均小于15％。附图说明图1为空白人血浆质谱图。图2为空白人血浆中加入OXC、MHD、MHD-G和内标硝基安定(Nitrazepam)的质谱图。图3为人血浆OXC的标准曲线图。图4为人血浆MHD的标准曲线图。图5为人血浆MHD-G的标准曲线图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例：人血浆OXC、MHD和MHD-G浓度的测定实验材料和仪器奥卡西平，纯度>99.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD‑G的检测方法，其特征是步骤为：（1）血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标硝基安定，再加入乙腈沉淀蛋白，离心取上清液，得到血浆样品；（2）色谱：将步骤（1）预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱：Phenomenex kinetex XB‑C18柱；流动相：乙腈:水体积比为50:50，水中含有质量浓度为0.1%的甲酸；流速：250~300μL/min；柱温：30~40℃；进样量：10μL；（3）质谱：离子源：电喷雾离子化ESI离子源，扫描方式：选择反应检测扫描SRM，喷雾电压：3500~4000V，鞘气：20~50psi，辅助气：10~20arb，毛细管温度：350℃，离子源温度：300℃；（4）计算：采用内标法，以OXC、MHD和MHD‑G和内标硝基安定的峰面积比值代入标准曲线方程，计算OXC、MHD和MHD‑G的血药浓度。

【技术特征摘要】
1.一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法，其特征是步骤为：（1）血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标硝基安定，再加入乙腈沉淀蛋白，离心取上清液，得到血浆样品；（2）色谱：将步骤（1）预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱：PhenomenexkinetexXB-C18柱；流动相：乙腈:水体积比为50:50，水中含有质量浓度为0.1%的甲酸；流速：250~300μL/min；柱温：30~40℃；进样量：10μL；（3）质谱：离子源：电喷雾离子化ESI离子源，扫描方式：选择反应检测扫描SRM，喷雾电压：3500~4000V，鞘气：20~50psi，辅助气：10~20arb，毛细管温度：350℃，离子源温度：300℃；（4）计算：采用内标法，以OXC、MHD和MHD-G和内标硝基安定的峰面积比值代入标准曲线...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄凯，蔡建美，过湘云，华颖，贺晴，
申请(专利权)人：无锡市人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32