一种测定人血浆/血清中卤米松的方法技术

本发明专利技术属于医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定血浆/血清中卤米松的方法。本发明专利技术建立了LC-MS/MS法测定血浆中的卤米松的含量，样品前处理方法采用微固相萃取技术，具有所需血浆样品量少，富集倍数高，溶剂用量少和操作简便等优点；色谱分离部分：采用细内径的色谱柱，流速极低，流动相消耗少，而且显著降低了基质效应，回收率和灵敏度得以改善；质谱检测：质谱信号选择其加合离子，使信号更加稳定，精密度好且灵敏度较高。本方法溶剂用量少，绿色环保，操作简便，分析周期短，适合于卤米松体内药物的浓度测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体设计一种测定血浆/血清中卤米松的方法。
技术介绍
卤米松（halometasone）（澳能）是一种强效糖皮质激素外用制剂，常用浓度为0.05%，具有强力的抗炎、抗表皮增生、抗渗出和止痒等作用，已在临床上广泛用于皮炎、湿疹、白癜风等多种非感染性炎症性皮肤病的治疗。临床研究表明，连续一周涂抹于400cm2的人体表面肌肤，卤米松的吸收仅为1.41%。目前，国内有文献报道的卤米松含量的测定方法有，微分脉冲极谱法和高效液相色谱法（HPLC），其中，HPLC法的最低定量限为0.008mg/ml，并不能满足临床检测人血浆中卤米松含量的灵敏度要求。另外，若采用液质联用法，则可使灵敏度得到提高，但往往存在基质效应影响和质谱响应值变动较大的问题。鉴于现有技术存在的问题，本申请的专利技术人拟提供一种测定人血浆/血清中卤米松的方法
技术实现思路
本专利技术的目的是克服有技术存在的缺陷，提供一种测定人血浆/血清中卤米松的方法。本专利技术方法能提高检测的选择性、稳定性和灵敏度。本专利技术建立了LC-MS/MS法测定血浆中的卤米松的含量。样品前处理方法采用微固相萃取技术，具有所需血浆样品量少，富集倍数高，溶剂用量少和操作简便等优点；色谱分离部分：采用细内径的色谱柱，流速极低，流动相消耗少，而且显著降低了基质效应，回收率和灵敏度得以改善；质谱检测：质谱信号选择其加合离子，使信号更加稳定，精密度好且灵敏度较高。具体的，本专利技术的一种测定人血浆/血清中卤米松的方法，其特征在于，采用细径柱分离和加合离子检测，其包括步骤：（1）待测样品分离和富集待测样品经离心后，取上清液适量，采用96孔装置进行分离、提取和富集，洗脱溶剂可少至50μL，无需挥干溶剂；（2）样品分析去上述洗脱液直接进样做LC/MS分析，采用细内经的色谱柱，进样量只需2μl即可达到较高的灵敏度；色谱条件：采用填料为十八烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，内经为1.0mm，高效液相系统采用通用型高压泵，流动相采用乙腈:0.2mmol·L-1乙酸铵水溶液，48:52（v/v），等度洗脱，流速为0.05mL·min-1；质谱条件：三重四极杆质谱检测器，卤米松产生[M+CH3COO]-加合离子，选择该加合离子为母离子，检测离子对为503.1/413.0，内标法定量。本方法中，待测样品为人血浆或血清。本方法中，色谱条件中色谱柱采用细内径分析柱(1.0×150mm，3.5μm)。本专利技术方法可用于卤米松体内浓度测定和体内过程的研究，本专利技术的实施例中所述的卤米松（halometasone）（澳能）为香港澳美制药厂生产。上述测定中，采用的色谱柱内经为1.0mm的液相色谱柱，其填料为十八烷基键合相硅胶，采用质谱检测器。本专利技术的测定人血浆/血清中卤米松的方法，采用的样品前处理和色谱流动相的溶剂消耗小，质谱分析采用了加合离子及其离子对，使检测信号稳定灵敏。本方法溶剂用量少，绿色环保，操作简便，分析周期短，适合于卤米松体内药物的浓度测定。本专利技术的有益效果有：采用96孔装置（Oasis μElution，美国Waters公司）分离蛋白并提取药物，前处理通量高；采用细内径的色谱柱，使上样量减少而灵敏度增加，基质效应大为降低；采用质谱检测器，以流动相添加剂产生的加合离子为检测信号，提高检测的选择性、稳定性和灵敏度。卤米松的最低检出限为0.2ng/ml血浆。线性范围为0.5-25Ang·mL-1，线性相关系良好，提取回收率91.61±0.20%～102.80±5.83%。天内及天间精密度RSD均小于10%。附图说明图1是卤米松质谱图（Q2扫描）。图2是人血浆样品中卤米松和内标（地塞米松）的LC-MS/MS的色谱图，其中，(A)空白血浆；(B)空白血浆加入卤米松（10ng·mL-1）和内标（50ng·mL-1）；(C)患者给药后1周的血样。具体实施方式实施例1按下述方法和步骤测定人血浆/血清中卤米松;高效液相色谱质谱联用条件：Agilent1200液相色谱系统（美国Agilent公司）包括：G1322A脱气装置、G1311A四元泵、G1329A自动进样装置、G1316A柱温箱，API4000Qtrap三重四级杆质谱仪（美国AB SCIEX公司）及其API4000Analyst1.5.1工作站；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（1.0×150mm，3.5μm，美国Agilent公司），柱温：30℃，流动相：乙腈：水（含0.2mmol·L-1乙酸铵）48:52，v/v，流速：0.05mL·min-1；质谱条件如表1所示；本实施例中由于在流动相中添加0.2mmol·L-1乙酸铵，使卤米松产生[M+CH3COO]-加合离子，因此选择该加合离子为母离子，检测离子对为503.1/413.0（如图1所示），获得的响应稳定且有较高的灵敏度，取前处理后的洗脱液2μL进行液质联用分析，典型色谱图如图2所示；表1：卤米松和地塞米松（内标）质谱条件血浆样品预处理：取500ng/mL内标溶液25μL于1.5mL尖底离心管中，加甲醇25μL，加血浆样品200μL，涡旋混匀后，以12,000rpm转速离心10min，取上清液200μL，使用96孔装置进行分离、浓集操作，具体操作流程如表2所示；表2：样品前处理操作流程线性试验：采用内标法定量，以卤米松与内标地塞米松的峰面积之比为Y，卤米松的浓度为X，以1/X2为权重以加权最小二乘法作线性回归，得回归方程Y=0.0783X+0.0045（r=0.9980），实验结果显示本方法在0.5-25ng·mL-1范围内线性良好；灵敏度：分别考察最低定量限（LLOQ，S/N≥10）及最低检测限（LLOD，S/N≥3），确定血浆中卤米松的LLOQ为0.5ng·mL-1，LLOD为0.2ng·mL-1，且LLOQ的天内及天间精密度分别为2.27%和8.09%，准确度分别为112.14%和109.99%；精密度和准确度：同日内，配制LLOQ、低中和高4个浓度血浆质控样品（0.5、1、10和20ng·mL-1）各5份，按上述方法操作和分析，以卤米松和内标地塞米松峰面积比值计算天内精密度和准确度，依照相同方法连续测定3天，计算天间精密度及准确，结果显示，本方法LLOQ的天内及天间精密度小于10%，准确度在1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定人血浆/血清中卤米松的方法，其特征在于，采用细径柱分离和加合离子检测，其包括步骤：（1）待测样品分离和富集待测样品经离心后，取上清液适量，采用96孔装置进行分离、提取和富集，洗脱溶剂少至50μL，无需挥干溶剂；（2）样品分析去上述洗脱液直接进样做LC/MS分析，采用细内经的色谱柱，进样量2μl；色谱条件：采用填料为十八烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，内经为1.0mm，高效液相系统采用通用型高压泵，流动相采用乙腈:0.2mmol·L‑1乙酸铵水溶液，48:52（v/v），等度洗脱，流速为0.05mL·min‑1；质谱条件：三重四极杆质谱检测器，卤米松产生[M+CH3COO]‑加合离子，选择该加合离子为母离子，检测离子对为503.1/413.0，内标法定量。

【技术特征摘要】
1.一种测定人血浆/血清中卤米松的方法，其特征在于，采用细径柱分离和加
合离子检测，其包括步骤：
（1）待测样品分离和富集
待测样品经离心后，取上清液适量，采用96孔装置进行分离、提取和富集，洗
脱溶剂少至50μL，无需挥干溶剂；
（2）样品分析
去上述洗脱液直接进样做LC/MS分析，采用细内经的色谱柱，进样量2μl；
色谱条件：采用填料为十八烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，内经为1.0mm，
高效液相系统采用通用型高压泵，流动相采用乙腈:0.2mmol·L-1乙酸铵水溶液，

【专利技术属性】
技术研发人员：郁韵秋，陈晨，郑捷，徐牧迟，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31