一种同时检测血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种同时检测测定血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒，所述试剂盒包括检测溶液R1、检测溶液R2、抗生物标志物阳性质控血清、抗生物标志物阴性质控血清和浓缩洗液通过联合检测人血浆中胰蛋 TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素的含量，实现对急性胰腺炎、其它腹腔脏器炎症性病变、急性消化道溃疡穿孔等引发急症腹痛疾病的排查，其检测方法是基于胶乳增强免疫比浊法，实现多指标联合检测达到引起常见急症腹痛疾病鉴别的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法同时测定血浆中胰蛋白酶原-2(TPSⅡ)、血清淀粉样蛋白A(SSA)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)与抵抗素含量的检测试剂盒，实现对急症腹痛常见疾病的排查，为临床医生做出及时合理的诊断提供辅助信息。
技术介绍
急症腹痛(acuteabdominalpain)是急诊患者最常见的病症之一。其就诊全年均可出现，高峰分别是秋季(9～11月)和夏季(6～8月)，就诊年龄集中在15～44岁之间(占就诊总数的72.7％)。常涉及内、外、儿、妇产甚至神经、精神各科的疾病。其主要病因是腹腔内脏器官发生病变、结构机能失常、腹外邻近器官损伤和/或全身性疾病所致。据统计，非创伤性急症腹痛疾病中急性胰腺炎的发病率最高，其次是急性胃肠炎、急性肠梗阻、急性阑尾炎、急性胆管炎、溃疡急性穿孔等。该类疾病往往具有发病急、变化快、病情复杂且严重等特点，加之，目前医院急诊科临床医生趋于年轻化，在急诊诊断方面经验不足，容易诊断有误或治疗欠妥，这样可能造成不良后果，甚至死亡。因此，对急症腹痛的诊断要求较高，能否及时做出明确的诊断，进行合理的治疗，将直接影响着疾病的治疗与预后。针对此现象，本专利技术提出将血清中胰蛋白酶原-2(TPSⅡ)、血清淀粉样蛋白A(SSA)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)与抵抗素进行联合检测的急症腹痛排查方案，研制相应的检测试剂盒，对急症腹痛常见的急性胰腺炎、急性阑尾炎、急性腹膜炎、急性胃肠炎与溃疡性急性穿孔进行排除。目前，国外在临床急症腹痛的检测方面，主要通过结合患者病史，进行体格检查、实验室辅助检查，根据患者病情选择性地进行血糖、妊娠试验、血电解质、肝肾功能、腹部CT检查、腹腔诊断性穿刺以及腹水分析等检查分析，然后综合考虑，提出相应的治疗方案。此外，还采用对急症腹痛患者尿胰蛋白酶原-2的检测，进行急性胰腺炎的排查，但对于急症腹痛相关的其他疾病的排查尚没有相关生物标记物的报道。在国内，对于急症腹痛的临床检测与国外临床检测相似，但TPSⅡ在国外临床诊断中的应用开展较早，而在国内是近两年陆续才开始在三级甲等医院走入临床应用，它的临床应用价值依旧处于进一步的探索中。本专利技术通过对急症腹痛患者血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素进行联合定量检测，对急症腹痛常见疾病进行排查，为临床医生做出及时合理的诊断提供辅助工具。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术在于提供一种同时测定血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素的试剂盒及其应用，通过建立一种多指标联合检测的免疫分析方法，为急症腹痛的相关疾病的排查提供一种灵敏度高、精确性好并且方便快速的试剂盒分析方法，帮助临床医生对急症腹痛相关疾病做出及时诊断，也为病情评估或预后判断进行辅助判断。技术手段：为实现上述技术目的，本专利技术提出了一种同时检测测定血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒，所述试剂盒包括检测溶液R1、检测溶液R2、抗生物标志物阳性质控血清、抗生物标志物阴性质控血清和浓缩洗液，其中，所述的检测溶液R1包括磷酸缓冲液和聚乙二醇6000；所述的检测溶液R2包括磷酸缓冲液、偶联有生物标志物抗体的致敏胶乳和稳定剂；所述的生物标志物包括TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素。具体地，所述的致敏胶乳由乳胶颗粒与生物标志物抗体通过物理吸附和/或共价结合得到。具体地，所述的致敏胶乳通过如下方法制备得到：(1)胶乳活化：本专利选用的胶乳粒径为80nm---200nm，胶乳加入适量的MES缓冲液中，超声破碎后，在搅拌的条件下向其中缓慢加入EDA和NHS，恒温孵育一段时间后，离心，去上清，再向沉淀中加入PBS缓冲液，进行超声破碎，从加入PBS到进行超声破碎的步骤重复进行1次，得到胶乳颗粒；(2)抗体交联：向胶乳颗粒中加入PBS，进行超声破碎后，向其中分别加入生物标志物的单克隆抗体(加入量为1.5-6mg/ml)，混匀后，置于室温下孵育一段时间，至反应液呈均匀分布状态，致敏胶乳；(3)封闭：用PBS缓冲液配制浓度为3.3％mg/ml的甘氨酸，将甘氨酸溶液与致敏胶乳按照体积比100:5混匀，超声破碎后，在25℃下孵育40～50min，然后向其中加入pH7.5、50mM包含0.05wt％BSA的PBS缓冲液，混匀后，25℃下孵育过夜；离心后，向其中加入PBS，超声破碎；离心去上清，加入0.05％吐温，经超声破碎后再次离心，去上清，加入0.05％的BSA后，进行超声破碎后，继续加入0.05％的BSA和0.1％的Proclin300，进行超声破碎，超声破碎的条件为100Hz，0.8s/次，共进行2分钟，然后4℃保存待用。其中，所述的胶乳颗粒为羧基聚苯乙烯微球、磁性聚苯乙烯微球、氨基聚苯乙烯微球、二甲氨基聚苯乙烯微球、磺化聚苯乙烯微球、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球等中的任意一种。优选地，所述的标志物抗体均为单克隆抗体，所述单克隆抗体均通过单克隆杂交瘤细胞技术制备得到或者通过噬菌体抗体技术筛选得到。所述的生物标志物阳性质控血清是在正常人血清中分别添加TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素标准品制得，添加量为正常血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的临界值的3倍；其中，正常血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素含量的临界值分别为50μg/L，0.5ng/mL，3mg/L，0.5ng/mL，14ng/mL；所述的生物标志物阴性质控血清是正常人血清。其中正常人血清TPSⅡ的含量低于50μg/L，SSA的含量低于0.5ng/mL，hs-CRP含量低于3mg/L，PCT的含量低于0.5ng/mL，抵抗素的含量低于14ng/mL。优选地，所述试剂盒包含五种不同颜色标记的检测杯，分别对血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素的检测，检测的线性范围依次为2.5μg/L～1250μg/L、0.1ng/mL～300ng/mL、0.3mg/L～150mg/L、0.1ng/mL～250ng/mL、1ng/mL～200ng/mL。本专利技术进一步提出了上述试剂盒在制备用于排查急症腹痛相关疾病的试剂上的应用。其中，所述的急症腹痛相关疾病为急性胰腺炎、急性腹膜炎、消化性溃疡急性穿孔、急性阑尾炎和败血症中的任意一种。本专利技术提出血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素的检测方案，通过将待检物质的相应抗体与胶乳颗粒进行偶联，通过抗原与抗体的特异结合，使得胶乳颗粒发生凝集，改变抗原抗体反应体系的浊度，提高检测的灵敏度，具体检测：通过血清TPSⅡ与hs-CRP的联合检测，对急性胰腺炎急性排查；通过联合检测血清中PCT与hs-CRP的含量，及时、有效地完成急性腹膜炎的诊断排查，有助于临床疗效的观察；通过血清SSA与hs-CRP的联合检测，对急性阑尾炎进行排查；通过对患者血清中抵抗素与hs-CRP的含量的检测，对溃疡性急性穿孔进性排查；此外，血清hs-CRP的水平对急性胃肠炎、急性胆管炎及急性肠梗阻等炎症疾病的早期诊断也存在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测测定血浆中TPSⅡ、SSA、hs‑CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测溶液R1、检测溶液R2、抗生物标志物阳性质控血清、抗生物标志物阴性质控血清，其中，所述的检测溶液R1包括磷酸缓冲液和聚乙二醇6000；所述的检测溶液R2包括磷酸缓冲液、偶联有生物标志物抗体的致敏胶乳和稳定剂Proclin300；所述的生物标志物包括TPSⅡ、SSA、hs‑CRP、PCT和抵抗素。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测测定血浆中TPSII、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测溶液R1、检测溶液R2、生物标志物阳性质控血清、生物标志物阴性质控血清，其中，所述的检测溶液R1包括磷酸缓冲液和聚乙二醇6000；所述的检测溶液R2包括磷酸缓冲液、偶联有生物标志物抗体的致敏胶乳和稳定剂Proclin300；所述的生物标志物包括TPSII、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素；所述的致敏胶乳通过如下方法制备得到：(1)胶乳活化：将乳胶加入适量的MES缓冲液中，超声破碎后，在搅拌的条件下向其中缓慢加入EDC和NHS，恒温孵育一段时间后，离心，去上清，再向沉淀中加入PBS缓冲液，进行超声破碎，从加入PBS到进行超声破碎的步骤重复进行1次，得到胶乳颗粒；(2)抗体交联：向胶乳颗粒中加入PBS，进行超声破碎后，向其中分别加入生物标志物的单克隆抗体，加入量为1.5～6mg/ml，混匀后，置于室温下孵育至反应液呈均匀分布状态，致敏胶乳；(3)封闭：用PBS缓冲液配质量体积比为3.3％的甘氨酸的溶液，将甘氨酸溶液与致敏胶乳按照体积比100∶5混匀，超声破碎后，在25℃下孵育40～50min，然后向其中加入pH7.5、50mM包含0.05wt％BSA的PBS缓冲液，混匀后，25℃下孵育过夜；离心后，向其中加入PBS，超声破碎；离心去上清，加入0.05％...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨子学，董梅，
申请(专利权)人：南京格耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32