一种从血浆中提取微小RNA的方法及其试剂盒技术

本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种从血浆中提取微小RNA的方法及其试剂盒，该方法包括：在血浆样品中加入裂解液，加入去蛋白液；加入RNA抽提试剂进行RNA抽提，再加入氯仿震荡混合，离心，收集上层液体；加入沉淀剂和助沉剂，离心，收集沉淀；用洗涤液进行洗涤，离心，收集沉淀，用RNase‑free的水进行溶解。本发明专利技术实施例的提取方法首先进行样品裂解和去蛋白，再进行RNA的抽提，使的与微小RNA结合的蛋白变性释放出游离的微小RNA并保持微小RNA的完整性；本发明专利技术实施例的试剂盒中，裂解液和去蛋白试液同时使用有助于充分降解与微小RNA结合的蛋白，沉淀剂异丙醇以及助沉剂糖原同时使用极大地提高了微小RNA回收效率。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及生物
，特别是涉及一种从血浆中提取微小RNA的方法及其试剂盒。
技术介绍
近年来，随着qPCR、RNA-seq等新兴分子生物学研究技术的不断发展，在RNA水平对生命事件进行更为深入的研究已逐渐成为生命科学领域的焦点。微小RNA(MicroRNAs、miRNAs)是一类长度在17～25个碱基的小分子非编码RNA，通过与靶基因转录本的互补结合，对靶基因的表达起负调节作用，或称为基因沉默。这种基因沉默效应在信号转导、干细胞发育、肿瘤发生发展、感染与免疫等多种生理、病理过程中发挥重要作用。研究表明，miRNA基因占预测基因总数的3％～5％，调控大约20％--30％的蛋白编码基因。miRNA成熟序列在不同物种中高度保守，在不同生物个体中的表达组织和时相也具有一定的保守性。近年来大量研究表明，微小RNA的表达水平与多种肿瘤发生密切相关。微小RNA既可以作为抑癌基因下调原癌基因活性，也可以作为癌基因下调抑癌基因活性。此外，许多研究报道微小RNA与其他疾病的发生发展具有密切联系，包括调节胰岛素分泌功能、影响神经元生成等。多种中枢神经系统疾病证明了微小RNA的病理生理作用，这些疾病包括脆性X染色体综合征、Rett综合征、唐氏综合征、孤独症、阿尔茨海默病、神经退行性疾病等。因而寻找疾病特异性miRNAs是未来分子诊断学发展的一个新方向。循环系统中的miRNAs广泛存在且非常稳定，随着疾病发生发展，循环miRNAs表达谱也会发生特异性改变，因此有可能成为疾病诊断、预后判断及疗效评价的新型生物标志物。目前，血浆微小RNA作为其中一种重要的途径已被广泛的应用于各类疾病的研究当中。然而，血浆miRNA的提取方法主要是采用国外进口试剂盒，但试剂盒提取血浆miRNA的具有价格昂贵、提取量少等缺点，提取的RNA总量往往不能满足后续实验要求。
技术实现思路
本申请主要解决的技术问题是提供一种从血浆中提取微小RNA的方法及其试剂盒，能够满足下游微小RNA(miRNA)芯片表达谱和其他分子生物学各项试验的质量要求。为解决上述技术问题，本专利技术实施例采用的一个技术方案是：提供一种从血浆中提取微小RNA的方法，包括如下步骤：步骤1：在血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，再在裂解混合物中加入去蛋白液进行蛋白降解，得到第一混合液；步骤2：在第一混合液中加入RNA抽提试剂进行RNA抽提，得到抽提混合物，再在抽提混合物中加入氯仿震荡混合，并进行低温离心分离，所得上层液体为第二混合液；步骤3：在第二混合液中加入沉淀剂和助沉剂进行RNA沉淀，得到沉淀混合物，将沉淀混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第一沉淀；步骤4：将第一沉淀用洗涤液进行洗涤，得到洗涤混合物，将洗涤混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第二沉淀，将第二沉淀用RNase-free的水进行溶解，所得溶液即为含有微小RNA的提取样品。可选地，在步骤1中，所述裂解液为质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，所述去蛋白液为20mg/ml的蛋白酶K溶液。可选地，在步骤2中，所述RNA抽提试剂为Trizol试剂，低温离心温度为2～6℃。可选地，在步骤3中，所述沉淀剂为异丙醇，所述助沉剂为糖原，低温离心温度为2～6℃。可选地，在步骤4中，所述洗涤液为体积百分比为70％～80％的乙醇溶液，低温离心温度为2～6℃。可选地，在步骤1中，所述血浆样品与裂解液的体积比为1：1；在步骤2中，所述RNA抽提试剂与第一混合液的体积比为2：1，所述氯仿与所述抽提混合物的体积比为1：5；在步骤3中，所述沉淀剂与第二混合液的体积比为1：1。可选地，在步骤1之前还包括由血液制备血浆的步骤。为解决上述技术问题，本专利技术实施例采用的另一个技术方案是：提供一种从血浆中提取微小RNA的试剂盒，包括裂解液、去蛋白液、RNA抽提试剂、沉淀剂、助沉剂和洗涤液，其中，所述沉淀剂为异丙醇，所述助沉剂为15mg/ml的糖原溶液。可选地，所述裂解液为质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，所述去蛋白液为20mg/ml的蛋白酶K溶液，所述RNA抽提试剂为Trizol试剂，所述洗涤液为体积百分比为70％～80％的乙醇溶液。可选地，还包括氯仿和RNase-free的水。本申请实施例的有益效果是：区别于现有技术的情况，本专利技术实施例的提取方法首先进行样品裂解和去蛋白，再进行RNA的抽提，使的与微小RNA结合的蛋白变性释放出游离的微小RNA并保持微小RNA的完整性；本专利技术实施例的试剂盒中，裂解液和去蛋白试液同时使用有助于充分降解与微小RNA结合的蛋白，沉淀剂异丙醇以及助沉剂糖原同时使用极大地提高了微小RNA回收效率。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动。图1是本专利技术实施例3与比较例提取RNA总量的比较图。图2是本专利技术实施例3与比较例提取外参cel-miR-39效率的比较图。图3是本专利技术实施例与比较例miRNA芯片扫描结果的组内比较图。图4是本专利技术实施例与比较例miRNA芯片扫描结果的组间比较图。具体实施方式为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本专利技术实施例为了满足下游微小RNA芯片表达谱和其他分子生物学各项试验的质量要求，提供一种从血浆中提取微小RNA的方法包括如下步骤：步骤1：在血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，再在裂解混合物中加入去蛋白液进行蛋白降解，得到第一混合液；步骤2：在第一混合液中加入RNA抽提试剂进行RNA抽提，得到抽提混合物，再在抽提混合物中加入氯仿震荡混合，并进行低温离心分离，所得上层液体为第二混合液；步骤3：在第二混合液中加入沉淀剂和助沉剂进行RNA沉淀，得到沉淀混合物，将沉淀混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第一沉淀；步骤4：将第一沉淀用洗涤液进行洗涤，得到洗涤混合物，将洗涤混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第二沉淀，将第二沉淀用RNase-free的水进行溶解，所得溶液即为含有微小RNA的提取样品。在一些可选实施方式中，在步骤1中，所述裂解液为质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，所述去蛋白液为20mg/ml的蛋白酶K溶液。在步骤2中，所述RNA抽提试剂为Trizol试剂，低温离心温度为2～6℃。在步骤3中，所述沉淀剂为异丙醇，所述助沉剂为糖原，低温离心温度为2～6℃。在步骤4中，所述洗涤液为体积百分比为70％～80％的乙醇溶液，低温离心温度为2～6℃。在步骤1中，所述血浆样品与裂解液的体积比为1：1；在步骤2中，所述RNA抽提试剂与第一混合液的体积比为2：1，所述氯仿与所述抽提混合物的体积比为1：5；在步骤3中，所述沉淀剂与第二混合液的体积比为1：1。在步骤1之前还包括由血液制备血浆的步骤。提取血浆中微小RNA的关键在于消除RNA降解酶(RNase)的污染和解离与微小RNA特异结合的蛋白。本专利技术实施例的方法在血浆中加入蛋白酶K主要有两个作用，一方面蛋白酶K可以灭活RNaseA，另一方面蛋白酶K可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从血浆中提取微小RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：在血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，再在裂解混合物中加入去蛋白液进行蛋白降解，得到第一混合液；步骤2：在第一混合液中加入RNA抽提试剂进行RNA抽提，得到抽提混合物，再在抽提混合物中加入氯仿震荡混合，并进行低温离心分离，所得上层液体为第二混合液；步骤3：在第二混合液中加入沉淀剂和助沉剂进行RNA沉淀，得到沉淀混合物，将沉淀混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第一沉淀；步骤4：将第一沉淀用洗涤液进行洗涤，得到洗涤混合物，将洗涤混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第二沉淀，将第二沉淀用RNase‑free的水进行溶解，所得溶液即为含有微小RNA的提取样品。

【技术特征摘要】
1.一种从血浆中提取微小RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：在血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，再在裂解混合物中加入去蛋白液进行蛋白降解，得到第一混合液；步骤2：在第一混合液中加入RNA抽提试剂进行RNA抽提，得到抽提混合物，再在抽提混合物中加入氯仿震荡混合，并进行低温离心分离，所得上层液体为第二混合液；步骤3：在第二混合液中加入沉淀剂和助沉剂进行RNA沉淀，得到沉淀混合物，将沉淀混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第一沉淀；步骤4：将第一沉淀用洗涤液进行洗涤，得到洗涤混合物，将洗涤混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第二沉淀，将第二沉淀用RNase-free的水进行溶解，所得溶液即为含有微小RNA的提取样品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述裂解液为质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，所述去蛋白液为20mg/ml的蛋白酶K溶液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2中，所述RNA抽提试剂为Trizol试剂，低温离心温度为2～6℃。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3中，所述沉淀剂为异丙醇，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪文旭，胡娜，段山，林圣，曾序春，邵豪，
申请(专利权)人：深圳市人口和计划生育科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44