一种从沙冬青提取基因组DNA的方法技术

一种从沙冬青提取基因组DNA的方法，包括如下步骤：(1)植物材料液氮速冻研磨成粉；(2)加DNA提取液并加蛋白酶K至20μg/mL，65℃保温；(3)离心收集上清液，加等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液抽提，再离心收集上清液；(4)加0.6～0.8倍体积异丙醇沉淀DNA；乙醇洗涤，部分干燥后溶于TE缓冲液，得DNA粗提液；(5)向DNA粗提液中加入NaCl至0.5mol/L，再加入CTAB/NaCl溶液，并加入RNase A至终浓度10μg/mL，65℃保温；(6)依次用等体积苯酚:氯仿:异戊醇混合液和等体积氯仿:异戊醇混合液抽提，收集上清液；(7)加0.6～0.8倍体积异丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗涤，部分干燥后溶于TE缓冲液，得到高质量的DNA提取液。本发明专利技术可以从沙冬青提取高质量的基因组DNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物DNA提取，特别是涉及一种从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法。
技术介绍
蒙古沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Maxim.)Chengf.]系豆科蝶形花亚科。沙冬青属超旱生常绿灌木，在中国主要分布于西北(新疆、宁夏、甘肃)及蒙古(阿拉善戈壁区东南端)，属国家重点保护植物。沙冬青具有很强的抗旱、抗寒及耐盐碱特性，也具有药用价值。沙冬青抗逆性的分子机制研究成为近年来的研究热点。沙冬青为超旱生灌木，体内多糖、酚类和其他次级代谢产物含量高。前人研究已经表明，蒙古沙冬青的叶片可溶性糖含量达到16％，多糖含量达到5.6％。目前常用的方法提取沙冬青基因组DNA，所得DNA质量不高、浓度较低，难以满足高通量测序实验中DNA文库构建的质量要求。
技术实现思路
为了弥补上述现有技术的不足，本专利技术提出一种从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法。本专利技术的技术问题通过以下的技术方案予以解决：一种从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法，包括如下步骤：(1)将植物材料经过液氮速冻后，研磨成粉末；(2)往所述粉末中DNA提取液分散均匀，然后加入蛋白酶K至所述蛋白酶K的终浓度20μg/mL，在65℃下保温1～2h，在保温期间，间歇摇动反应液，其中，所述DNA提取液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为15mL:2～5g；(3)离心除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提2～3次，然后再次离心后收集抽提后的上清液；(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA充分析出得到DNA沉淀；用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，部分干燥以除去残留乙醇后，将DNA沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；(5)往步骤(4)中所得的DNA粗提液中加入NaCl至NaCl的终浓度为0.5mol/L，随后加入CTAB/NaCl溶液，再加入RNaseA至RNaseA的终浓度为10μg/mL，在65℃下保温一段时间；其中，所述CTAB/NaCl溶液的加入量为每1mLDNA粗提液加入1.5mLCTAB/NaCl溶液；(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提后，离心之后收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提，离心之后收集上清液；(7)往步骤(6)中得到的抽提后的上清液中加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA析出，所得DNA沉淀使用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液中，得到高质量的DNA提取液。本专利技术与现有技术对比的有益效果包括：本专利技术提供的提取方法克服了沙冬青植物材料中富含的多糖、多酚等次生代谢产物对完整DNA提取步骤的干扰，解决了常规DNA提取方法中常见的DNA产率低、易降解、其他代谢产物残留多的难题。采用本专利技术的方法得到的DNA纯度较高，DNA完整性好、无明显降解现象，适用于进行基因组文库构建、高通量DNA测序等分子生物学实验。附图说明图1是本专利技术实施例中提取的8个DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图。图2是本专利技术实施例中提取的DNA样品1和2的脉冲场凝胶电泳图。具体实施方式下面对照附图并结合优选的实施方式对本专利技术作进一步说明。基因组DNA的提取是分子生物学实验中非常重要的一个环节，基因组DNA的质量与产量，对于进行基因组DNA文库构建等分子生物学研究具有重要意义。酚类物质和多糖是影响植物基因组DNA提取的两个重要因素，常导致DNA分子降解，严重影响DNA纯度和产量。沙冬青植物组织富含糖类和酚类等物质，酚类物质容易发生氧化，与DNA结合形成黄色或褐色沉淀，难以溶解，DNA纯度较低，难以满足分子生物学研究需求，因此，有效去除多糖、蛋白质和酚类物质等，是提取高质量DNA分子的关键。本专利技术实施例中的提取方法，先用SDS(十二烷基硫酸钠)法粗提DNA，然后用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)进行进一步的纯化，CTAB可与核酸形成复合物，从而可把DNA从富含多酚和多糖的植物组织中分离出出来，去除多糖和酚类物质，这样不仅所得的DNA比较纯净、完整性好，而且大大减低了CTAB的用量，降低了实验成本。在本专利技术中，所述的常温是指20～25℃，低温离心是指在4℃条件下离心。基于以上考虑，本专利技术提供的从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法，在具体实施方式中，包括如下步骤：(1)将植物材料经过液氮速冻后，研磨成粉末；(2)往所述粉末中DNA提取液分散均匀，然后加入蛋白酶K至所述蛋白酶K的终浓度20μg/mL，在65℃下保温1～2h，在保温期间，间歇(每隔5～10min)摇动反应液，其中，所述DNA提取液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为15mL:2～5g；(3)离心除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提2～3次，然后再次离心后收集抽提后的上清液；优选地，步骤(3)具体为：在常温4000×g下离心10min除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液，抽提2～3次，然后在常温12000×g下离心10min，收集抽提后的上清液；(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA充分析出得到DNA沉淀；用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，部分干燥以除去残留乙醇后，将DNA沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；优选地，步骤(4)具体为：(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的在0℃以下预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀，于-20℃下静置1～2h，使DNA充分析出，然后在12000×g下低温离心10min使DNA沉淀；用在0℃以下预冷的体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，然后在12000×g下低温离心10min，倒掉乙醇，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；(5)往步骤(4)中所得的DNA粗提液中加入NaCl至NaCl的终浓度为0.5mol/L，随后加入CTAB/NaCl溶液，再加入RNaseA至RNaseA的终浓度为10μg/mL，在65℃下保温一段时间，其中，所述CTAB/NaCl溶液的加入量为每1mLDNA粗提液加入1.5mLCTAB/NaCl溶液；优选地，所述保温时间为15min；(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提后，离心之后收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提，离心之后收集抽提后的上清液；优选地，步骤(6)具体为：(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液，充分混匀，在12000×g下常温离心10min，收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提一次，在12000×g下常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将植物材料经过液氮速冻后，研磨成粉末；(2)往所述粉末中DNA提取液分散均匀，然后加入蛋白酶K至所述蛋白酶K的终浓度20μg/mL，在65℃下保温1～2h，在保温期间，间歇摇动反应液，其中，所述DNA提取液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为15mL:2～5g；(3)离心除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提2～3次，然后再次离心后收集抽提后的上清液；(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA充分析出得到DNA沉淀；用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，部分干燥以除去残留乙醇后，将DNA沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；(5)往步骤(4)中所得的DNA粗提液中加入NaCl至NaCl的终浓度为0.5mol/L，随后加入CTAB/NaCl溶液，再加入RNase A至RNase A的终浓度为10μg/mL，在65℃下保温一段时间；其中，所述CTAB/NaCl溶液的加入量为每1mL DNA粗提液加入1.5mL CTAB/NaCl溶液；(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提后，离心之后收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提，离心之后收集上清液；(7)往步骤(6)中得到的抽提后的上清液中加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA析出，所得DNA沉淀使用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液中，得到高质量的DNA提取液。...

【技术特征摘要】
1.一种从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将植物材料经过液氮速冻后，研磨成粉末；(2)往所述粉末中DNA提取液分散均匀，然后加入蛋白酶K至所述蛋白酶K的终浓度20μg/mL，在65℃下保温1～2h，在保温期间，间歇摇动反应液，其中，所述DNA提取液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为15mL:2～5g；(3)离心除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提2～3次，然后再次离心后收集抽提后的上清液；(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA充分析出得到DNA沉淀；用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，部分干燥以除去残留乙醇后，将DNA沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；(5)往步骤(4)中所得的DNA粗提液中加入NaCl至NaCl的终浓度为0.5mol/L，随后加入CTAB/NaCl溶液，再加入RNaseA至RNaseA的终浓度为10μg/mL，在65℃下保温一段时间；其中，所述CTAB/NaCl溶液的加入量为每1mLDNA粗提液加入1.5mLCTAB/NaCl溶液；(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提后，离心之后收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提，离心之后收集上清液；(7)往步骤(6)中得到的抽提后的上清液中加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA析出，所得DNA沉淀使用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液中，得到高质量的DNA提取液。2.如权利要求1所述的从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：(3)在常温4000×g下离心10min除去组织碎片，
\t收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液，抽提2～3次，然后在常温12000×g下离心10min，收集抽提后的上清液；所述步骤(4)具体为：(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的在0℃以下预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀，于-20℃下静置1～2h，使DNA充分析出，然后在12000×g下低温离心10min使DNA沉淀；用在0℃以下预冷的体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，然后在12000×g下低温离心10...

【专利技术属性】
技术研发人员：何军贤，冯磊，
申请(专利权)人：香港中文大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44