一种用于提取块茎、块根高质量RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于提取块茎、块根高质量RNA的方法，包括以下步骤：用直径3mm的硬质塑料管沿块根、块茎打孔，获得直径3mm，长5mm圆柱体，8个装1管置于液氮中速冻后保存于‑80℃的环境中；取口部的内径8.5cm研钵加入3勺液氮冻冷，再加入第4勺时取出已冻好的样品倒入研钵，在液氮挥发过程中小心压碎薯块，液氮挥发完时迅速磨成细粉；迅速将粉末装入EP管中，加1mL Trizol，剧烈混匀，室温放5‑10min；将上述得到的混合物进行离心并用有机溶剂提取纯化RNA。本发明专利技术提取的RNA纯度高、完整性好，能用于后续分子实验，并能在‑80℃保存至少半年时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种用于提取块茎、块根高质量RNA的方法。
技术介绍
目前常采用的植物总RNA提取方法主要有异硫氰酸胍法、CTAB法、SDS法、Trizol法，而针对马铃薯块茎、甘薯块根、山药块茎的RNA提取研究中，所用方法各异，试剂配制繁琐，没有统一的针对这些地下生长材料的高质量RNA提取方法。针对块茎、块根部位基因表达的研究增多，而获得高质量RNA是其中的关键环节之一。目前这些块茎、块根类材料RNA提取存在如下问题：第一，马铃薯、甘薯、山药、魔芋等地下块茎、块根类材料液氮速冻后硬度大，研磨难；第二，块茎、块根材料淀粉、多糖含量高并且含有较多的次生代谢产物，如多酚、色素等。多糖会和RNA形成黏稠状物质，使其难溶于水；多酚类在研磨时被释放出来被氧化成醌类物质，它们能与RNA稳定结合，影响RNA分离。这些因素会影响总RNA提取质量，不利于后续分子生物学研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对以上的问题，提供了一种用于提取块茎、块根高质量RNA的方法，本技术从取样方式、去多糖等方面，研究开发出一套提取块茎、块根类RNA的方法，本方法统一规范取样方式、取样量和速冻等环节，通过低浓度乙醇、高盐、冻融等多种方式去除淀粉和多糖的影响，开发出一套能提取含多糖、多酚、淀粉材料的总RNA提取方法，该方法能稳定且高效提取RNA用于后续的northernblot，高通量测序等实验。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种用于提取块茎、块根高质量RNA的方法，包括以下步骤：1)取样：用直径3mm的硬质塑料管沿块根、块茎打孔，获得直径3mm，长5mm圆柱体，8个装1管置于液氮中速冻后保存于-80℃的环境中；2)研磨：取口部的内径为8.5cm的研钵加入3勺液氮冻冷，再加入第4勺时取出已冻好的样品倒入研钵，在液氮挥发过程中小心压碎样品块，液氮挥发完时迅速磨成细粉；迅速将粉末装入EP管中，加1mLTrizol，剧烈混匀，室温放5-10min；3)将步骤2)得到的混合物进行离心并用有机溶剂提取纯化RNA。进一步地，步骤3)中的将步骤2)得到的混合物进行离心并用有机溶剂提取纯化RNA具体为：3.1)4℃、12000rpm离心5min，直接倒上清入已加200μL氯仿的新管中，上下颠倒15s混匀，室温放5min；以下在冰上操作：3.2)4℃、12000rpm离心10min，就近吸取上清到新管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀；3.3)4℃、12000rpm离心20min，吸取上清到新管，逐滴加入无水乙醇至乙醇终浓度为12％，上下颠倒混匀后迅速离心；3.4)4℃、12000rpm离心10min，吸取上清到新管，加入0.7倍体积异丙醇颠倒混匀，并加入0.2倍体积1MNaAc-20℃沉淀30-60min；3.5)4℃、12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL75％乙醇，洗沉淀3遍；3.6)倒掉上清，超净台上吹风10min，加入80μLDEPC处理水，立即放入55℃水浴5min，-80℃冻60min，重复2次冻融；3.7)4℃，12000rpm离心20min，小心吸取上清60-70μL，注意不接触沉淀，-80℃保存至少半年不降解。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)所用试剂简单常见，不需要配制复杂危险的溶液；2)能稳定且高效地获得硬质、高淀粉、高多糖的块茎、块根类材料的RNA；3)提取的RNA纯度高、完整性好，能用于后续分子实验，并能在-80℃保存至少半年时间。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术用于提取块茎、块根高质量RNA的方法的取样方式和研磨及用量要求；图2是本专利技术用于提取块茎、块根高质量RNA的方法的工艺流程图；图3是本专利技术的实施例2-5中的电泳图；其中，1-4分别代表：马铃薯、甘薯、山药、魔芋样品提取的RNA。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实验准备包括常规的用0.1％DEPC处理EP管和枪头，DEPC处理水，配制酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，1M醋酸钠50mL(称取6.804g，加水至50mL，加50μLDEPC，37℃，150rpm，7-8h后再121℃高温处理20min)，Trizol提取试剂。实施例1用于提取块茎、块根高质量RNA的方法用于提取块茎、块根高质量RNA的方法的工艺流程图如图1所示，包括以下步骤：1)取样：用直径3mm的硬质塑料管沿块根、块茎打孔，获得直径3mm，长5mm圆柱体，8个装1管置于液氮中速冻后保存于-80℃。取样的方式及用量：用硬质容器(塑料管)统一打孔成小圆柱体，便于对不同部位精确取样(如芽眼部位、薄壁组织、维管组织、髓部)，同时利于研磨。2)研磨：取口部的内径为8.5cm的研钵加入3勺液氮冻冷，再加入第4勺时取出已冻好的样品倒入研钵(液氮基本装满研钵)，在液氮挥发过程中小心压碎薯块，液氮将挥发完时迅速磨成细粉。迅速将粉末(6-7勺即可)装入EP管中，加1mLTrizol，剧烈混匀，室温放5-10min。3)提取纯化RNA，过程如图2所示，3.1)4℃、12000rpm离心5min，直接倒上清入已加200μL氯仿的新管中，上下颠倒15s混匀，室温放5min；以下在冰上操作：3.2)4℃、12000rpm离心10min，就近吸取上清到新管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀；3.3)4℃、12000rpm离心20min，吸取上清到新管，逐滴加入无水乙醇至乙醇终浓度为12％，上下颠倒混匀后迅速离心；3.4)4℃、12000rpm离心10min，吸取上清到新管，加入0.7倍体积异丙醇颠倒混匀，并加入0.2倍体积1MNaAc-20℃沉淀30-60min；3.5)4℃、12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL75％乙醇，洗沉淀3遍；3.6)倒掉上清，超净台上吹风10min，加入80μLDEPC处理水，立即放入55℃水浴5min，-80℃冻60min，重复2次冻融；3.7)4℃，12000rpm离心20min，小心吸取上清60-70μL，注意不接触沉淀，-80℃可保存至少半年不降解。其中，酚/氯仿/异戊醇用于进一步除蛋白，低浓度乙醇利于沉淀多糖，NaAc用于防止多糖与RNA一起沉淀出来，75％乙醇多次清洗以除去盐，55℃和-80℃反复冻融可以促进一些融于水的多糖析出，同时使被多糖包裹的RNA溶解。实施例2马铃薯块茎芽眼部位RNA提取按上述方法，以芽眼部位为中心取样8个，研磨后迅速装入粉末7勺，加1mLTrizol，剧烈混匀，室温放5min。4℃、12000rpm离心5min，直接倒上清入已加200μL氯仿的新管中，上下颠倒15s混匀，室温放5min。4℃、12000rpm离心10min，就近吸取上清600μL到新管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀。4℃、12000rpm离心20min，吸取上清500μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于提取块茎、块根高质量RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取样：用直径3mm的硬质塑料管沿块根、块茎打孔，获得直径3mm，长5mm圆柱体，8个装1管置于液氮中速冻后保存于‑80℃的环境中；2)研磨：取口部的内径8.5cm研钵加入3勺液氮冻冷，再加入第4勺时取出已冻好的样品倒入研钵，在液氮挥发过程中小心压碎样品块，液氮挥发完时迅速磨成细粉；迅速将粉末装入EP管中，加1mLTrizol，剧烈混匀，室温放5‑10min；3)将步骤2)得到的混合物进行离心并用有机溶剂提取纯化RNA。

【技术特征摘要】
1.一种用于提取块茎、块根高质量RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取样：用直径3mm的硬质塑料管沿块根、块茎打孔，获得直径3mm，长5mm圆柱体，8个装1管置于液氮中速冻后保存于-80℃的环境中；2)研磨：取口部的内径8.5cm研钵加入3勺液氮冻冷，再加入第4勺时取出已冻好的样品倒入研钵，在液氮挥发过程中小心压碎样品块，液氮挥发完时迅速磨成细粉；迅速将粉末装入EP管中，加1mLTrizol，剧烈混匀，室温放5-10min；3)将步骤2)得到的混合物进行离心并用有机溶剂提取纯化RNA。2.根据权利要求1所述的用于提取块茎、块根高质量RNA的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的将步骤2)得到的混合物进行离心并用有机溶剂提取纯化RNA具体为：3.1)4℃、12000rpm离心5min，直接倒上清入已加200μL氯仿的新管中，上下颠倒15s混匀，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹雪，丁凡，余金龙，王西瑶，黄雪丽，刘丽芳，余韩开宗，陈年伟，
申请(专利权)人：绵阳市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：四川;51