一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用技术
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因扩增
，具体是一种植物内生菌16SrRNA基因扩增方法及应用。
技术介绍
植物内生菌是植物微生态系统中的重要组成部分，在长期协同进化过程中其与植物形成了相互依存的关系。植物内生菌可以产生活性物质作为生物纺织资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药卫生领域有着巨大的应用前景。虽然经过多年的研究，但目前植物内生细菌的研究还是处于初级阶段，对于植物内生细菌在植物中的分布及丰度调查还依赖于传统的分离纯化后使用通量较低的DGGE等方法，即使采用高通量测序进行的相关研究也因为植物宿主本身的质体和线粒体的干扰，造成植物内生细菌的研究始终处在基础研究的水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服植物内生细菌传统研究方法中需培养分离和植物宿主基因干扰等技术局限，提供一种植物内生菌16SrRNA基因扩增方法及应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种植物内生菌16SrRNA基因扩增方法，具体步骤如下：(1)植物预处理：取植物样本0.5-1g，经超声清洗后在超净台中使用有效率浓度2％的次氯酸钠溶液浸泡消毒4-6m...
【技术保护点】
一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)植物预处理：取植物样本0.5‑1g，经超声清洗后在超净台中使用有效率浓度2％的次氯酸钠溶液浸泡消毒4‑6min，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70‑75％的乙醇溶液浸泡25‑35s，随后使用无菌水冲洗3‑5遍彻底去除样本表面消毒剂；(2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管中，通过CTAB法纯化样本总DNA；(3)样本16S rRNA基因的扩增：包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增；31)16S rR...
【技术特征摘要】
1.一种植物内生菌16SrRNA基因扩增方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)植物预处理：取植物样本0.5-1g，经超声清洗后在超净台中使用有效率浓度2％的次氯酸钠溶液浸泡消毒4-6min，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，随后使用无菌水冲洗3-5遍彻底去除样本表面消毒剂；(2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管中，通过CTAB法纯化样本总DNA；(3)样本16SrRNA基因的扩增：包括16SrRNA基因全长的乳液PCR扩增和16SrRNA基因高变区/保守区扩增子扩增；31)16SrRNA基因全长的乳液PCR扩增①设计三对引物AP1429/F-R，MTR/F-R和CHP/F-R均以原核生物和植物16SrRNA基因为模板，其中MTR/F-R和CHP/F-R引物3’末端以C3spacer或C5spacer修饰，红色标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制植物宿主来源的污染，AP1429/F-R引物对用于植物内生细菌16SrRNA基因的扩增；②配置植物内生细菌16SrRNA基因的乳液PCR混合液，该混合液由体积为1:1的乳液发生剂和PCR扩增缓冲液混合而成。③将步骤②用于扩增植物内生细菌16SrRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mLPCR管中并置于带有热盖功能的PCR仪中，在PCR以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温；④向步骤③每个PCR管的反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200×g离心4-6min，离心完成后取下层水相溶液为模板进行16SrRNA基因高变区/保守区扩增子扩增，结果检测通过吸取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物对的PCR产物作为阳性对照，回收目的条带；32)16SrRNA基因高变区/保守区扩增子扩增：以31)中的④步骤水相反应产物为模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR扩增缓冲液中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的PCR循环条件下完成，结果通...
【专利技术属性】
技术研发人员：张时恒，孙梓健，安家兴，刘驰，涂波，
申请(专利权)人：成都罗宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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