核酸纯化方法技术

本申请公开了一种纯化多核酸的方法，所述方法包括吸附多核酸至滤器，用水不混溶性溶液洗涤滤器，并从滤器洗脱多核酸。该方法可以用于制备纯化的RNA和/或DNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及纯化核酸如DNA或RNA的方法，包括从临床样品或其他血液、细胞或组织样品类型纯化此类核酸。专利技术背景应用DNA和RNA样品的分子生物学技术常常依赖于获得纯化的核酸样品。DNA或RNA的来源众多，如组织、细胞、全血、血浆、血清、提取物，其可以获自生物体(例如，人、动物、植物、细菌、病毒等)，还比如在实验室开发或保持的组织或细胞培养物。DNA或RNA的进一步应用通常需要分离DNA或RNA与样品源中的其他组分，以使多核酸不含其他细胞酶、蛋白质、化合物和/或碎片。分离DNA或RNA与这些其他物质使通过以下技术对多核酸的后续处理成为可能：例如PCR、RT-PCR、TMA、LAMP、LCR、测序、核酸杂交分析或使用核酸的基于酶的反应或杂交反应领域中已知的众多技术中的任一种。最早的分离DNA或RNA的技术之一是使用例如蛋白酶K裂解细胞或组织样品，向裂解物中添加等体积的苯酚/氯仿溶液来提取非核酸物质(例如，蛋白质、细胞器等)，并移出含有核酸的水相以供进一步使用。通常，通过用乙醇或异丙醇沉淀从水相回收核酸。该技术的改良包括进一步向有机相添加少量的异戊醇以助于RNases失活，和/或添加离液剂(chaotropic agent)如硫氰酸胍以助于蛋白质变性和酶失活。虽然苯酚/氯仿提取因其提供了高纯度和高回收率而被认为是通过移除非核酸物质来纯化核酸的“金标准”，但是该方法仍有缺点，如费力，难以自动化，并需要使用有危害的有机溶剂。后来，开发了基于吸收核酸至固相、洗掉不想要的物质并洗脱核酸的技术。该固相常常为二氧化硅颗粒，但也使用其他材料如玻璃纤维、玻璃珠或玻璃粉、羟磷灰石、阴离子交换树脂和硅藻土。多核酸在离液序列高的盐(chaotropic salt)的存在下结合至固相，使用含醇的溶液洗掉未结合的物质，最后使用低离子强度溶液从固相洗脱多核酸以获得基本纯形式的多核酸。几家公司提供有特征在于使用固相物质的DNA和RNA纯化试剂盒。这类试剂盒通常以柱、膜的形式或者作为顺磁性颗粒上的涂层提供固相材料。当使用顺磁性颗粒时，使用磁铁来隔绝颗粒同时除去洗涤或洗脱缓冲液。然而，顺磁性颗粒相对比较贵，并且操控颗粒增加了自动化的成本。当使用柱或膜作为固相时，通过离心或施加真空抽除洗涤或洗脱缓冲液。柱和膜的设计和处理要求使得洗涤液在通过整个空隙容积时是有效的。固相内的液体滞留或者类似地未充分洗除固相中的空隙空间意味着未除去将干扰或污染核酸产物的杂质、抑制剂或其他化合物。常常使用离心以试图均一地除去液体，但自动化系统必定更大、更复杂和昂贵。整体来说，尝试改进现有技术的方法仍遭遇下列一种或多种问题：(1)核酸产物的收率低，(2)废洗涤液的体积增加；(3)核酸产物溶液比想要的更稀；(4)留有PCR抑制剂；和(5)处理时间长。因此，仍期望基于易于自动化的简单液体操作步骤的方法。专利技术人观察到使用玻璃微纤维滤器作为核酸纯化的固相材料所得产物的纯度不足以用于使用标准方案的基于酶的后续处理。例如，将细胞样品用裂解缓冲液处理并且通过压力使裂解物通过玻璃微纤维滤器以使核酸(DNA和RNA)与玻璃纤维结合。然后通过压力用乙醇水溶液洗涤滤器两次，并使用不含核酸酶的水洗脱核酸。使用获得的物质作为靶标进行PCR的后续尝试导致扩增反应失败。通过使用对照反应证实在获得的物质中存在抑制剂。因此，仍需要与厚的和/或较大的和/或不同孔径的滤器相兼容的核酸样品纯化方法，以便实现快速、高通量、高纯度获取核酸样品，以及可修正为紧凑系统中的自动化但处理约1mL或更多的样品体积同时降低操作成本的方法。专利技术概述本文提供了纯化多核酸的方法，该方法采用滤器作为固相以及压力驱动操作。第一实施方案包括：(1)使多核酸吸附至滤器，(2)用不混溶流体洗涤液洗涤滤器，和(3)使用基于水的洗脱溶液从滤器洗脱多核苷酸，以获得纯化的多核酸的溶液。第二实施方案包括：(1)使多核酸吸附至滤器，(2)用基于醇的洗涤液洗涤滤器，(3)用不混溶流体洗涤液洗涤滤器，和(4)使用基于水的洗脱溶液从滤器洗脱多核苷酸，以获得纯化的多核酸的溶液。第三实施方案包括：(1)使多核酸吸附至滤器，(2)用不混溶流体洗涤液洗涤滤器，(3)用基于醇的洗涤液洗涤滤器，(4)用不混溶性流体洗涤液洗涤滤器，和(5)使用基于水的洗脱溶液从滤器洗脱多核苷酸，以获得纯化的多核酸的溶液。进一步的实施方案包括用两种或更多种不同组成的基于醇的洗涤液和/或两种或更多种不同组成的不混溶性流体洗涤液洗涤滤器。进一步的实施方案包括在任一上述实施方案中的洗脱步骤之后，用不混溶性流体洗涤液洗涤滤器。在另一实施方案中，洗脱步骤通过以下进行：在滤器的入口侧放置基于水的洗脱溶液，使不混溶性流体洗涤液在基于水的洗脱溶液的顶部或后面分层，以及使两种溶液通过滤器以获得在水相中的纯化的多核酸的溶液。可以使用各种实施方案的方法来纯化任何类型的多核酸，如DNA、RNA和/或DNA和RNA的混合物。多核酸可以是天然来源的(例如，从任何类型的细胞提取的)或合成的。本文还提供了一种系统，该系统包括：固相和具有多孔底部的容器，该多孔底部可以将固相保留在容器内；液体递送装置，用于向该容器中的固相递送至少一种不混溶性洗涤液、洗脱溶液以及任选的基于醇的洗涤液，所述系统可以实施本专利技术的方法。该系统可以进一步包含压力源，其可提供压头以驱动任何溶液通过容器内的固相。该系统还可以进一步包含真空源，其可引起任何溶液流动通过容器内的固相。在又一个实施方案中，该系统可以进一步包含离心机，其能够提供离心力以驱动任何溶液通过容器内的固相。在一些实施方案中，实施该方法的装置具有用于处理单样品的隔室和滤器，而在其他实施方案中，提供多个隔室和滤器组进行多样品处理，其在一些情况中能平行进行。作为多样品处理的一个实例，可使用具有多孔性孔底部的多孔微滴定板作为容器，并且滤器能配在每个孔中。可将用于单样品或多样品处理的装置并入到系统中，以手动地、半自动地或自动地实施该方法。当结合附图阅读以下本专利技术描详述时，本专利技术的这些和其他目的和特征将变得更完全显而易见的。附图简述图1示出了可用于实施纯化方法的实施方案的装置的一个实施方案。图2A-2B示出了根据实施例3描述的本专利技术实施方案获得的纯化的核酸样品的实时RT-PCR分析的生长曲线。图3A-3B示出了根据实施例3描述的本专利技术实施方案获得的纯化的核酸样品的实时RT-PCR分析产物的熔解曲线。图4A-4B示出了由根据实施例3描述的本专利技术实施方案制备的样品获得的PCR产物的电泳分析结果。图5示出了根据实施例5描述的本专利技术实施方案获得的纯化的核酸样品的实时PCR分析的生长曲线。图6示出了根据实施例5描述的本专利技术实施方案获得的纯化的核酸样品的实时PCR分析产物的熔解曲线。图7示出了由根据实施例5描述的本专利技术实施方案制备的样品获得的PCR产物的电泳分析结果。专利技术详述关注的DNA或RNA包括活着的或已死亡的所有生物如人、其他哺乳类动物、其他动物、植物、细菌、病毒或任何其他生命形式的DNA或RNA。在一些实施方案中，DNA或RNA是天然存在的多核酸，并且所述方法可以用作从它们在细胞内的天然来源提取多核酸或用于从裂解物纯化多核酸的方案的一部分。所述来源可以是临床样品，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化多核酸的方法，所述方法包括：(a)使多核酸吸附至适配于容器中的滤器；(b)用第一不混溶流体洗涤液洗涤所述滤器；以及(c)使用基于水的洗脱溶液从所述滤器洗脱所述多核酸；其中，获得纯化的多核酸的溶液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.11 US 61/978,3221.一种纯化多核酸的方法，所述方法包括：(a)使多核酸吸附至适配于容器中的滤器；(b)用第一不混溶流体洗涤液洗涤所述滤器；以及(c)使用基于水的洗脱溶液从所述滤器洗脱所述多核酸；其中，获得纯化的多核酸的溶液。2.权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：在步骤(a)之后且在步骤(b)之前，用基于醇的洗涤液洗涤所述滤器。3.权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：在步骤(a)之后且在步骤(b)之前，用第二不混溶流体洗涤液洗涤所述滤器，然后用基于醇的洗涤液洗涤所述滤器。4.权利要求1、2或3任一项所述的方法，其中所述多核酸是DNA和/或RNA。5.权利要求1、2或3任一项所述的方法，所述方法进一步包括：在步骤(c)中，使用(i)基于水的洗脱溶液和(ii)不混溶流体推动溶液从所述滤器洗脱所述多核酸。6.权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：滨田貴俊，大卫·斯温森，
申请(专利权)人：和光纯药工业株式会社，和光生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP