基于Ion Torrent测序平台融合基因检测文库的构建方法及融合基因检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Ion Torrent测序平台融合基因检测文库的构建方法及融合基因检测的方法。其中，该构建方法包括以下步骤：S1，对样品DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，对DNA片段进行末端修复及加碱基A；S3，连接序列已知的接头；S4，进行PCR扩增，得到样本核酸文库；S5，将样本核酸文库基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获融合基因及伴侣基因的DNA片段；以及S6，将S5的产物通过PCR引入测序接头序列，得到融合基因检测文库。应用本发明专利技术的技术方案，解决了现有技术中Ion Torrent测序平台因RNA样本不合格导致无法检测基因融合及无法检测未知融合断点的融合类型问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库的构建方法及融合基因检测的方法。
技术介绍
基因融合属于基因结构变异的一种，是指两个或多个基因的编码区首尾相连，于同一套调控序列控制之下，构成的嵌合基因。融合基因的表达产物为融合蛋白。随着大规模平行测序(二代测序)成本的不断降低以及目标区域捕获技术的不断成熟，基于二代测序技术的基因检测得到越来越多的应用。二代测序与传统检测方法相比，具有灵敏度高，准确性高，价格低廉，可以同时检测多种靶点的优势。市面上主流的测序平台主要有两个，分别是Illumina公司的荧光可逆性终止法测序以及ThermoFisher公司的半导体离子流测序(IonTorrent)。目标区域捕获利用序列捕获技术将目标区域的DNA捕捉并富集，结合高通量测序平台进行测序的研究策略。与全基因组测序相比其优势在于研究区域集中，大大降低测序费用，周期和工作量；适用于高深度测序，发现低频突变。捕获的方式主要有两种，一种是以ThermoFisher公司为代表的基于多重PCR的扩增子捕获技术，通过在目标区域的上下游设计引物将感兴趣的区域捕获；还有就是以Agilent公司为代表的液相杂交捕获技术，该技术通过针对目标区域设计cRNA或者cDNA探针进行捕获。该方法的优势是借助探针可以捕获到目标区域的侧翼，从而可以检测与目标区域发生基因融合的区域，因此可以在DNA水平检测未知的基因融合。IonAmpliseqTM是ThermoFisher公司开发的基于多重PCR对目标区域进行捕获的技术。该技术在检测融合基因方面采用的是在转录组层面(RNA水平)的扩增子建库方式，并且只能根据特定的融合位点形式设计多重PCR的引物。因此，针对每一个样本，都需要既提取DNA又提取RNA。而临床样本复杂性高，特别是福尔马林固定石蜡包埋的组织(FFPE)样本，由于保存时间较长且保存方式不规范，导致核酸的提取比较困难。并且RNA比DNA更容易发生降解，这就造成了许多样本由于RNA提取失败造成无法检测融合基因的情况发生。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库的构建方法及融合基因检测的方法，以解决现有技术中IonTorrent测序平台因RNA样本不合格导致无法检测基因融合及无法检测未知融合断点的融合类型问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库的构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，对样品DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，对DNA片段进行末端修复及3’端添加碱基A；S3，将3’端连接有A碱基的DNA片段末端连接序列已知的接头；S4，根据序列已知的接头，进行PCR扩增，得到样本核酸文库；S5，将样本核酸文库基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获融合基因及伴侣基因的DNA片段，采用洗脱液去除捕获过程中引入的非特异性产物；以及S6，将S5的产物通过PCR引入IonTorrentProton测序接头序列，得到基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库。进一步地，S1中，样本DNA不足100ng时，加入500ng的载体RNA进行辅助打断。进一步地，S1具体包括：采用超声波打断仪将样品DNA打断成主带在150bp～300bp的DNA片段。进一步地，序列已知的接头为Illumina测序平台的测序接头。进一步地，S6中，PCR引物的5’端含有IonTorrentproton测序的接头序列，3’端与序列已知的接头有13bp的重叠序列。进一步地，样品DNA来自福尔马林固定石蜡包埋的组织。根据本专利技术的另一个方面，提供一种基于IonTorrent测序平台融合基因检测的方法。该方法包括以下步骤：采用上述任一种构建方法构建基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库；以及在IonTorrent的Proton测序平台上进行测序，分析测序结果得到融合基因检测的结果。进一步地，在IonTorrent的Proton测序平台上进行测序之前，使用安捷伦2100Bioanalyzer检测插入片段大小，以及使用qPCR定量检测文库产量。进一步地，分析测序结果包括：过滤掉含“N”的测序序列与低质量测序序列后，采用BWA软件进行序列比对产生bam文件，再采用IGV软件进行软截断序列查看。应用本专利技术的技术方案，IonTorrent测序平台结合液相杂交捕获技术，基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获融合基因及伴侣基因的DNA片段，然后用IonTorrent测序平台测序，解决了现有技术中IonTorrent测序平台因RNA样本不合格导致无法检测基因融合及无法检测未知融合断点的融合类型问题。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了根据本专利技术的基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库的构建方法的流程示意图；图2-1和图2-2示出了实施例1的XHC样本CCDC6-RET的融合断点IGV查看结果示意图；图3-1和3-2示出了实施例1的DYT样本TPM3-ROS1融合断点的IGV查看结果示意图；以及图4-1和4-2示出了实施例1的FSH样本EML4-ALK融合断点的IGV查看结果图示意图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供一种基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库的构建方法。如图1所示，该构建方法包括以下步骤：S1，对样品DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，对DNA片段进行末端修复及3’端添加碱基A；S3，将3’端连接有A碱基的DNA片段末端连接序列已知的接头；S4，根据序列已知的接头，进行PCR扩增，得到样本核酸文库；S5，将样本核酸文库基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获融合基因及伴侣基因(partnergene)的DNA片段，采用洗脱液去除捕获过程中引入的非特异性产物；以及S6，将S5的产物通过PCR引入IonTorrentProton测序接头序列，得到基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库。IonTorrent测序平台结合液相杂交捕获技术，基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获融合基因及伴侣基因的DNA片段，然后用IonTorrent测序平台测序，解决了现有技术中IonTorrent测序平台因RNA样本不合格导致无法检测基因融合及无法检测未知融合断点的融合类型问题。采用本专利技术的技术方案构建的目标区域捕获文库可以在IonTorrentProton测序仪上进行测序，能够稳定地产出数据，并且可以从微量融合阳性样本中准确检测到目标基因融合及给出正确的融合形式。优选的，S1中，样本DNA不足100ng时，加入500ng的载体RNA(CarrierRNA)进行辅助打断。这是因为如果样本DNA不足100ng，由于DNA含量低，在超声波破碎时可能会对样本造成严重破坏，因此添加载体RNA(CarrierRNA)起到保护样本DNA的作用。优选的，S1具体包括：采用超声波打断仪将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Ion Torrent测序平台融合基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，对样品DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，对所述DNA片段进行末端修复及3’端添加碱基A；S3，将3’端连接有A碱基的DNA片段末端连接序列已知的接头；S4，根据所述序列已知的接头，进行PCR扩增，得到样本核酸文库；S5，将所述样本核酸文库基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获融合基因及伴侣基因的DNA片段，采用洗脱液去除捕获过程中引入的非特异性产物；以及S6，将所述S5的产物通过PCR引入Ion Torrent Proton测序接头序列，得到所述基于Ion Torrent测序平台融合基因检测文库。

【技术特征摘要】
1.一种基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，对样品DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，对所述DNA片段进行末端修复及3’端添加碱基A；S3，将3’端连接有A碱基的DNA片段末端连接序列已知的接头；S4，根据所述序列已知的接头，进行PCR扩增，得到样本核酸文库；S5，将所述样本核酸文库基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获融合基因及伴侣基因的DNA片段，采用洗脱液去除捕获过程中引入的非特异性产物；以及S6，将所述S5的产物通过PCR引入IonTorrentProton测序接头序列，得到所述基于IonTorrent测序平台融合基因检测文库。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述S1中，所述样本DNA不足100ng时，加入500ng的载体RNA进行辅助打断。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述S1具体包括：采用超声波打断仪将所述样品DNA打断成主带在150bp～300bp的DNA片段。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述序列已知的接头为Illumi...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋智，张振宇，师文霞，李晓敏，夏贇，高长欣，
申请(专利权)人：天津诺禾医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12