用于高通量测序的DNA文库构建方法技术

本发明专利技术公开了一种扩增子测序文库的构建方法，包括用多对融合引物对从待测样品获得的DNA模板进行多重PCR，回收PCR产物，得到测序文库；其中所述多对融合引物分别针对DNA模板上的不同目的片段，融合引物包含针对目的片段的特异性引物序列和测序接头序列；其中多重PCR按下述反应条件进行：95℃2min；38个循环，每个循环为95℃30s，然后从76℃到55℃和58℃之间的任意温度缓慢降温，每秒降0.1℃，待降至58℃后保持20s，然后72℃30s；72℃2min，4℃保持。本发明专利技术还公开了该文库构建方法在高通量测序检测STR基因座和亲权鉴定中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种用于高通量测序的DNA文库构建方法。
技术介绍
法医DNA检验技术的研究和分析对象主要是生物体内DNA的多态性。一般来说，基因或非编码区的DNA标记在染色体上的位置称为基因座，而位于同一个基因座上不同序列的基因被称为等位基因。DNA多态性就是指作为遗传标记的基因座存在多个等位基因，分析基因座上等位基因的差异就是实现同一认定的生物学基础[1]。微卫星DNA中的短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)[2]是一种DNA多态性，广泛存在于人类基因组的23对染色体上，通常由2-6bp的重复单位(或称核心序列，coresequence)组成，不同个体(或等位基因)之间的差异一般只表现为重复单位的重复数目差异。STR基因座是一种重要的遗传标记，在多态性程度高的基因座上，其个体识别能力强，并且可以简单地用PCR技术检测出来，因而被广泛应用。STR基因座具有以下特点：STR多态性基因座数量多，片段长度一般小于400bp，易于扩增，适于微量检材的检验；等位基因大小比较接近，较小等位基因优先扩增不明显；不同位点的STR基因座片段长度差异较小，便于复合扩增，提高检测效率。STR基因座的分型检验技术在法医DNA检验、亲权鉴定中有着重要作用。我国大多数亲权鉴定实验室都使用多基因座STR分型技术作为主要手段，对不同的STR基因座多态性进行分析、比对并计算亲权指数(PI值，即真父可能性与假父可能性的比值)。依据国际上多数实验室[3]采用的标准(PI值≥10000)作为区分是否“存在亲生关系”的界线。传统的STR分型技术多以PCR技术和毛细管电泳技术为基础，使用荧光标记的引物对样品进行多重PCR扩增，产生不同大小的扩增片段并在毛细管电泳中分离，从而实现分型，但这种方法通量较低，而且由于分析的对象是片段长度，无法进一步检测核酸一级结构的微小差异，限制了检测的分辨率，此外，在存在混合样品时可能出现Stutter峰(片段分析时出现于主峰前的小峰)的干扰。而Sanger测序法由于通量、成本的原因，难以用于STR分型分析。二代高通量测序技术(NextGenerationSequencing)技术可以一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，促进了测序技术的高速发展。利用二代高通量测序技术可以对全基因组进行测序。当研究者只对特定的基因组区域感兴趣的时候，可以利用扩增子测序(AmpliconSequencing)方法只对相应区域进行测序研究。通过设计感兴趣的基因组区域的引物，进行PCR扩增，对目标区域进行富集，然后针对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行建库，高通量测序并进行序列分析。目前的扩增子测序都是通过常规的建库方法，在通过PCR扩增富集到目标区域后，进行混样，然后进行末端修复和加A，再加接头，纯化样品，回收目的条带，然后PCR扩增，再跑胶回收主带，这种常规的建库方法步骤繁琐、浪费时间、工作量大，不利于大量样品的测序建库。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种扩增子测序文库的构建方法以及该文库构建方法在高通量测序检测STR基因座中的应用，该方法可以通过一次扩增实现扩增子测序文库的构建，简化建库的操作过程，降低建库的时间和成本，同时不影响测序质量。根据本专利技术的一个方面，提供一种扩增子测序文库的构建方法，包括用多对融合引物对从待测样品获得的DNA模板进行多重PCR，回收PCR产物，得到测序文库；其中所述多对融合引物分别针对DNA模板上的不同目的片段，每对融合引物从5'端到3'端依次包含测序接头序列和针对目的片段的特异性引物序列。在优选的实施方案中，多重PCR按下述反应条件进行：95℃2min；38个循环，每个循环为95℃30s，然后从76℃到55℃和58℃之间的任意温度缓慢降温，每秒降0.1℃，待降至目的温度后保持20s，然后72℃30s；72℃2min。本专利技术中，所述“多对融合引物”是指两对、三对、或更多对融合引物。在更优选的实施方案中，多重PCR按下述反应条件进行：95℃2min；38个循环，每个循环为95℃30s，然后从76℃到58℃缓慢降温，每秒降0.1℃，待降至58℃后保持20s，然后72℃30s；72℃2min。在一些实施方案中，待测样品包括但不限于血液、体液、唾液、精液、毛发、肌肉或组织器官。在优选的实施方案中，DNA模板是从待测样品中提取的基因组DNA。本专利技术中，每对融合引物分别包含针对目的片段的特异性正向引物序列和反向引物序列。在一些实施方案中，测序接头序列中包含index序列，以标识不同的DNA模板，便于将不同样品混合测序。本专利技术中融合引物中所包含的测序接头序列可以是：上游引物中5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'，下游引物中5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-index序列-GAT-3'。本专利技术中融合引物中所包含的测序接头序列还可以是：上游引物中5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-第一index序列-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'，下游引物中5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT+第二index序列+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'。其中第一index序列与第二index序列是不同的index序列。在一些实施方案中，多重PCR反应分1个或多个反应体系来完成。在优选的实施方案中，一个反应体系中包含两个、三个、四个、或五个针对不同目的片段的融合引物对。在优选的实施方案中，所述目的片段是STR基因座。在优选的实施方案中，目的片段包括选自下述STR基因座的两种或更多种STR基因座：CSF1PO(GenBankX14720)、FGA(GenBankM64982)、TH01(GenBankD00269)、TPOX(GenBankM68651)、D3S1358(NT_005997positions754983-755121)、D5S818(GenBankAC008512)、D7S820(GenBankAC004848)、D8S1179(GenBankAF216671)、D13S317(GenBankAL353628)、D16S539(GenBankAC024591)、D18S51(GenBankAP001534)、D21S11(GenBankAP000433)、D2S1338(GenBankAC010136)、CD4(GenbankM86525)、D12S391(GenbankM08921)、PLA2A1(GenbankM22970)、FABP(GenbankM18079)、D18S865(GenbankAC012289.12)和VWA(GenbankM25858)。在更优选的实施方案中，目的片段包括下述所有STR基因座：CSF1PO(GenBankX14720)、FGA(GenBankM64982)、TH01(GenBankD00269)、TPOX(GenBankM68651)、D3S1358(NT_005997positions754983-755121)、D5S818(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增子测序文库的构建方法，包括用多对融合引物对从待测样品获得的DNA模板进行多重PCR，回收PCR产物，得到测序文库；其中所述多对融合引物分别针对DNA模板上的不同目的片段，每对融合引物从5'端到3'端依次包含测序接头序列和针对目的片段的特异性引物序列；其中多重PCR按下述反应条件进行：95℃2min；38个循环，每个循环为95℃30s，然后从76℃到55℃和58℃之间的任意温度缓慢降温，每秒降0.1℃，待降至目的温度后保持20s，然后72℃30s；72℃2min。

【技术特征摘要】
1.一种扩增子测序文库的构建方法，包括用多对融合引物对从待测样品获得的DNA模板进行多重PCR，回收PCR产物，得到测序文库；其中所述多对融合引物分别针对DNA模板上的不同目的片段，每对融合引物从5'端到3'端依次包含测序接头序列和针对目的片段的特异性引物序列；其中多重PCR按下述反应条件进行：95℃2min；38个循环，每个循环为95℃30s，然后从76℃到55℃和58℃之间的任意温度缓慢降温，每秒降0.1℃，待降至目的温度后保持20s，然后72℃30s；72℃2min。2.权利要求1的构建方法，其中DNA模板是从待测样品中提取的基因组DNA。3.权利要求1的构建方法，其中多重PCR反应分1个或多个反应体系完成...

【专利技术属性】
技术研发人员：王旭，钟嘉泳，张弓，董鸣，余卓，
申请(专利权)人：承启医学深圳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44