构建测序文库的方法及设备技术

本发明专利技术提供了一种构建测序文库方法及设备，所述方法包括：(1)将mRNA打断，以便获得片段化mRNA；(2)将所述片段化mRNA去磷酸化，以便获得去磷酸化mRNA；(3)将所述去磷酸化mRNA连接3’端接头，以便获得连接产物；(4)将所述连接产物进行反转录，以便获得cDNA；(5)从所述cDNA分离单链DNA；以及(6)将所述单链DNA进行环化，以便获得环状DNA，所述环状DNA构成所述测序文库。利用本发明专利技术的该方法，可以利用非常微量的RNA用于构建文库，且无需进行PCR。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及构建测序文库的方法及设备，以及测序的方法及系统。
技术介绍
随着高通量测序技术的应用和发展，第二代测序平台日趋成熟、稳定，存在的主要问题是文库制备步骤繁琐、成本居高不下，所以第二代基因测序还无法满足市场的要求，走入千家万户。解决这个问题的关键在于减少起始样本的投入量和简化文库制备步骤。传统从总RNA中构建cDNA文库需要依赖oligo(dT)，从而将信息RNA捕获出来。这些信息再通过反转录合成一链和二链，加上接头，再经过PCR扩增形成适用于高通量测序的cDNA文库。目前存在的方法有一个局限在于开始投入的RNA产量需要达到数百ng到μg之间，以满足在多种酶反应过程中和在PCR扩增前一系列纯化回收步骤导致的丢失。因而，目前关于从总RNA中构建cDNA文库的相关研究仍有待深入。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种从非常低的RNA投入量构建cDNA文库适用于高通量测序的构建测序文库的方法。在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种构建测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：(1)将mRNA打断，以便获得片段化mRNA；(2)将所述片段化mRNA去磷酸化，以便获得去磷酸化mRNA；(3)将所述去磷酸化mRNA连接3’端接头，以便获得连接产物；(4)将所述连接产物进行反转录，以便获得cDNA；(5)从所述cDNA分离单链DNA；以及(6)将所述单链DNA进行环化，以便获得环状DNA，所述环状DNA构成所述测序文库。专利技术人发现，利用本专利技术的该方法，能够快速有效的构建测序文库，且该方法能够有效减少样品提取的数量和切胶和胶纯化回收步骤，可以利用非常微量的RNA用于构建文库，RNA的起始量只需要pg级别就能满足要求；在单管中利用连续反应无缝衔接接头连接和反转录，不仅能够简化纯化步骤，还可以缩短文库构建的时间，提高效率；另外，该方法无需进行PCR，能够有效避免PCR带来的偏差(bias)问题，而且步骤简单，利于实现高通量、自动化应用。根据本专利技术的实施例，所述步骤(3)和所述步骤(4)是在同一容器中进行的。根据本专利技术的实施例，所述步骤(1)的起始mRNA是采用去核糖体RNA方法从总RNA中分离纯化获得的。根据本专利技术的一些实施例，所述去核糖体RNA方法包括：将所述总RNA与oligoDNA进行退火处理，将所述退火处理得到的产物进行RNaseH酶消化，将所述RNaseH酶消化得到的产物进行DNaseI酶消化，以及将所述DNaseI酶消化得到的产物进行磁珠纯化，以便获得所述mRNA，其中，所述OligoDNA是可与rRNA杂交的寡核苷酸单链片段，其长度为45-60bp，优选为45-55bp。由此，能够高效地分离获得mRNA。根据本专利技术的实施例，所述步骤(5)是通过以下步骤进行的：(a)向反转录产物中加入1MNaOH，在PCR仪上反应98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；(b)向步骤(a)中所得到的混合物中加入水，然后进行乙醇沉淀，并用1×TE重悬。根据本专利技术的实施例，所述步骤(4)的反转录是采用携带生物素的引物进行的。根据本专利技术的实施例，所述步骤(6)进一步包括：将所述单链DNA进行单链环化反应，以便获得单链环化反应产物；利用链霉素磁珠对所述单链环化反应产物进行筛选，以便获得所述环状DNA。在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种测序方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：通过前面所述的方法构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序。专利技术人发现，利用本专利技术的该方法，能够快速、有效的进行测序，且通过前面所述的方法构建测序文库能够有效减少样品提取的数量和切胶和胶纯化回收步骤，可以利用非常微量的RNA用于构建文库，RNA的起始量只需要pg级别就能满足要求；在单管中利用连续反应无缝衔接接头连接和反转录，不仅能够简化纯化步骤，还可以缩短文库构建的时间，提高效率；另外，该方法无需进行PCR，能够有效避免PCR带来的偏差(bias)问题，而且步骤简单，利于实现高通量、自动化应用。在本专利技术的第三方面，本专利技术提供了一种构建测序文库的设备。根据本专利技术的实施例，该设备包括：片段化装置，所述片段化装置用于将mRNA打断，以便获得片段化mRNA；去磷酸化装置，所述去磷酸化装置用于将所述片段化mRNA去磷酸化，以便获得去磷酸化mRNA；接头连接装置，所述接头连接装置用于将所述去磷酸化mRNA连接3’端接头，以便获得连接产物；反转录装置，所述反转录装置用于将所述连接产物进行反转录，以便获得cDNA；分离装置，所述分离装置用于从所述cDNA分离单链DNA；以及环化装置，所述环化装置用于将所述单链DNA进行单链环化，以便获得环状DNA，所述环状DNA构成所述测序文库。利用本专利技术的该设备，能够有效实施前面所述的构建测序文库的方法，可以利用非常微量的RNA用于构建文库，RNA的起始量只需要pg级别就能满足要求；不需要复杂的纯化装置，且不需进行PCR，不仅设备简单，成本低廉，且能够缩短文库构建的时间，大大提高效率。根据本专利技术的实施例，进一步包括：提取装置，所述提取装置用于利用去核糖体RNA方法从总RNA中分离纯化所述mRNA。在本专利技术的一些实施例中，提取装置中设置有oligoDNA，所述OligoDNA是长度为45-60bp，优选45-55bp的寡核苷酸单链片段，具有选自SEQIDNO.:1-195中至少之一所示的序列。根据本专利技术的实施例，所述分离装置进一步包括：热解单元，所述热解单元用于向反转录产物中加入1MNaOH，在PCR仪上反应98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；以及沉淀单元，所述沉淀单元用于向所述热解单元中所得到的混合物中加入水，然后进行乙醇沉淀，并用1×TE重悬。根据本专利技术的实施例，所述反转录装置中设置有携带生物素的引物，，用于进行反转录反应。根据本专利技术的实施例，所述环化装置进一步包括：环化反应单元，所述环化反应单元用于将所述单链DNA进行单链环化反应，以便获得单链环化反应产物；筛选单元，所述筛选单元用于利用链霉素磁珠对所述单链环化产物进行筛选，以便获得所述环状DNA。在本专利技术的第四方面，本专利技术提供了一种测序系统。根据本专利技术的实施例，该系统包括：前面所述的构建测序文库的设备；以及测序设备。专利技术人发现，利用本专利技术的该系统能够快速、有效的实施前面所述的测序方法，且通过前面所述的设备构建测序文库能够有效减少样品提取的数量和切胶和胶纯化回收步骤，可以利用非常微量的RNA用于构建文库，RNA的起始量只需要pg级别就能满足要求；还可以在单管中利用连续反应无缝衔接接头连接和反转录，不仅能够简化纯化步骤，还可以缩短文库构建的时间，提高效率；另外，该系统无需进行PCR，能够有效避免PCR带来的偏差(bias)问题，而且操作简单，利于实现高通量、自动化应用。附图说明图1显示了根据本专利技术的实施例，构建测序文库的方法的流程示意图；图2显示了根据本专利技术的实施例，构建测序文库的技术原理概要图；图3显示了根据本专利技术的实施例，构建测序文库的设备的结构示意图；图4显示了根据本专利技术的实施例，构建获得的测序文库的电泳结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建测序文库的方法，其特征在于，包括：(1)将mRNA打断，以便获得片段化mRNA；(2)将所述片段化mRNA去磷酸化，以便获得去磷酸化mRNA；(3)将所述去磷酸化mRNA连接3’端接头，以便获得连接产物；(4)将所述连接产物进行反转录，以便获得cDNA；(5)从所述cDNA分离单链DNA；以及(6)将所述单链DNA进行环化，以便获得环状DNA，所述环状DNA构成所述测序文库。

【技术特征摘要】
1.一种构建测序文库的方法，其特征在于，包括：(1)将mRNA打断，以便获得片段化mRNA；(2)将所述片段化mRNA去磷酸化，以便获得去磷酸化mRNA；(3)将所述去磷酸化mRNA连接3’端接头，以便获得连接产物；(4)将所述连接产物进行反转录，以便获得cDNA；(5)从所述cDNA分离单链DNA；以及(6)将所述单链DNA进行环化，以便获得环状DNA，所述环状DNA构成所述测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述步骤(3)和所述步骤(4)是在同一容器中进行的。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的起始mRNA是采用去核糖体RNA方法从总RNA中分离纯化获得的，任选地，所述去核糖体RNA方法包括：将所述总RNA与oligoDNA进行退火处理，将所述退火处理得到的产物进行RNaseH酶消化，将所述RNaseH酶消化得到的产物进行DNaseI酶消化，以及将所述DNaseI酶消化得到的产物进行磁珠纯化，以便获得所述mRNA，其中，所述OligoDNA是可与rRNA杂交的寡核苷酸单链片段，其长度为45-60bp，优选为45-55bp。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)是通过以下步骤进行的：(a)向反转录产物中加入1MNaOH，在PCR仪上98℃反应20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；(b)向步骤(a)中所得到的混合物中加入水，然后进行乙醇沉淀，并用1×TE重悬。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的反转录是采用携带生物素的引物进行的。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)进一步包括：将所述单链DNA进行单链环化反应，以便获得单链环化反应产物；利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪晓钧，郭晶，祝珍珍，耿春雨，章文蔚，蒋慧，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44