无创产前胎儿β 型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒。文库构建方法中，对母体外周血游离DNA片段连接特异性的接头，然后将接头连接产物预扩增产物分成两部分，分别独立地使用针对目标位点的上、下游引物进行两轮特异性扩增，能够高特异性地富集目标位点，显著提高引物扩增特异性。并且分别使用用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上、下游引物组进行两轮特异性扩增，能够高效、准确的计算胎儿游离DNA比例。对本发明专利技术的文库进行测序，能够准确、高效地检测β型地贫基因突变，其结果与羊水穿刺检测分型一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。

【技术实现步骤摘要】
无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒。
技术介绍
地中海贫血(简称地贫)是全世界的高发病率遗传病之一，是由于人体基因突变或者缺失而导致α，β-珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫常见的两种类型是α-地贫和β-地贫，α-地贫相关基因为HBA2和HBA1，β-地贫相关基因为HBB。地贫集中在热带和亚热带地区，多发生于地中海沿岸国家，其次为中东、印度、巴基斯坦、东南亚、中国南方和北非，美国是移民国家，其发生率也较高。我国长江以南各省是地贫高发区，广东、广西、海南、台湾和香港等地受累人口超过2亿。中国人群中，α-地贫的基因型别常见的有-αSEA、-α3.7、-α4.2、αCS、αQS和αWS，β-地贫常见的有26种基因突变型别。目前地贫尚无根治的方法，只能依靠传统方法治疗，即以输血治疗为主，价格昂贵，因此产前筛查和诊断对预防该种出生缺陷疾病具有重大意义。1997年，卢煜明发现孕妇外周血浆中存在来自于胎儿的游离DNA，这一发现为通过孕妇外周血无创产前诊断和检测胚胎基因型提供了新的可能，随着高通量测序技术的应用，无创产前检测胚胎染色体异常(如21、18、13染色体非整倍体变异)以及部分大的拷贝数变异已经成功应用于临床产前筛查和诊断，但是孕妇体内胎儿游离DNA仅占孕妇血浆中总游离DNA的3％-6％，对于胎儿无创式的遗传性疾病的检测带来挑战。不断有研究人员尝试通过孕妇外周血游离DNA对胎儿地贫基因做出检测，由于孕妇外周血中存在大量母源游离DNA，所以如何有效区分胚胎基因的突变，对检测方法的灵敏度提出了很高的要求。目前临床报道产前检测地贫基因突变的方法有几种：传统的羊膜穿刺、腹绒毛活检等，由于是有创伤性的操作，可能伴有胎儿损伤、流产或宫内感染等风险。利用母体血浆中游离胎儿DNA的无创产前诊断也有些研究。ChiuRW通过使用实时荧光PCR技术实现了对父源codons41/424bp缺失的有效检测，还有科研工作者发展了针对其他β地贫点突变的检测方法，但由于检测突变多为点突变，方法的特异性有待提高。对于α地贫突变的研究也有报道，WaruneeTungwiwat等人，建立了基于荧光定量PCR检测α0缺失的方法，然而该方法的灵敏度有待提高。此外，多种高灵敏度的技术方法也被尝试用于无创地贫检测，如质谱、数字PCR、COLD-PCR等。但这些基于单一位点的PCR技术的检测方法存在一定的局限性，如血浆DNA低含量及高度片段化的特点，很可能会带来PCR的假阴性。这种方法只能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，而无法进一步确定母源突变的存在与否。基于高通量测序技术的孕妇血浆游离DNA的全基因组测序或者目标区域捕获测序可以更加准确的实现对胎儿地贫基因的检测，但全基因组测序的成本以及分析方法的复杂性和需要父母单体型等限制了在临床上的应用；目标区域捕获测序由于其目标区域捕获效率低，仅能实现对胎儿αSEA缺失纯杂合型的区分，并且还存在分型错误的可能。鉴于此，需要提供一种高精确度的无创产前胎儿地贫基因突变检测方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒，能够准确、高效地检测β型地贫基因突变，其结果与羊水穿刺检测分型一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法，上述文库用于通过高通量测序进行无创产前胎儿β型地贫基因突变的检测，上述方法包括：(a)对母体外周血游离DNA连接带有特异标签序列和任选的样本标签序列的接头序列；(b)使用预文库扩增引物序列对上一步的连接产物进行预文库扩增，其中上述预文库扩增引物序列与上述接头序列互补结合；(c)将上一步得到的预文库分为上游预文库和下游预文库，分别使用上游特异性引物组1和下游特异性引物组1对上述上游预文库和下游预文库进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，其中，上述上游特异性引物组1包括用于扩增β型地贫基因的上游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1；上述下游特异性引物组1包括用于扩增β型地贫基因的下游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1；(d)对上述上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，分别使用上游特异性引物组2和下游特异性引物组2进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2，其中，上述上游特异性引物组2包括用于扩增β型地贫基因的上游引物组2以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组2；上述下游特异性引物组2包括用于扩增β型地贫基因的下游引物组2以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2；并且，上述上游特异性引物组2相比上述上游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点，上述下游特异性引物组2相比上述下游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点；上述上游特异性引物组2和上述下游特异性引物组2的5’端含有用于高通量测序文库的接头序列；(e)将上述上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2混合后，使用两端的通用引物进行扩增，得到可上机测序的文库。进一步地，上述上游特异性引物组1和下游特异性引物组1的5'端带有用于分离扩增产物的修饰，优选带有生物素修饰。进一步地，上述上游特异性引物组1中针对特定目标位点的引物的3’端，与上述上游特异性引物组2中针对该目标位点的引物的5’端有10-15个碱基的重合；上述下游特异性引物组1中针对特定目标位点的引物的3’端，与上述下游特异性引物组2中针对该目标位点的引物的5’端有10-15个碱基的重合。进一步地，上述用于扩增β型地贫基因的上游引物组1序列如SEQIDNO：1-7所示；上述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1序列如SEQIDNO：8-17所示；上述用于扩增β型地贫基因的下游引物组1序列如SEQIDNO：18-25所示；上述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1序列如SEQIDNO：26-35所示；上述用于扩增β型地贫基因的上游引物组2序列如SEQIDNO：36-42所示；上述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组2序列如SEQIDNO：43-52所示；上述用于扩增β型地贫基因的下游引物组2序列如SEQIDNO：53-59所示；上述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2序列如SEQIDNO：60-69所示。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测方法，包括对第一方面的方法构建的文库进行高通量测序得到测序读长(reads)；然后，根据位点的唯一的特异标签序列的总深度和突变等位基因(allele)的深度，计算胎源DNA含量并对地贫相关的突变进行分型以分析β型地贫基因突变情况。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建试剂盒，上述文库用于通过高通量测序进行无创产前胎儿β型地贫基因突变的检测，上述试剂盒包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法，所述文库用于通过高通量测序进行无创产前胎儿β型地贫基因突变的检测，其特征在于，所述方法包括：(a)对母体外周血游离DNA连接带有特异标签序列和任选的样本标签序列的接头序列；(b)使用预文库扩增引物序列对上一步的连接产物进行预文库扩增，其中所述预文库扩增引物序列与所述接头序列互补结合；(c)将上一步得到的预文库分为上游预文库和下游预文库，分别使用上游特异性引物组1和下游特异性引物组1对所述上游预文库和下游预文库进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，其中，所述上游特异性引物组1包括用于扩增β型地贫基因的上游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1；所述下游特异性引物组1包括用于扩增β型地贫基因的下游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1；(d)对所述上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，分别使用上游特异性引物组2和下游特异性引物组2进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2，其中，所述上游特异性引物组2包括用于扩增β型地贫基因的上游引物组2以及用于计算胎儿游离DNA比例的上游引物组2；所述下游特异性引物组2包括用于扩增β型地贫基因的下游引物组2以及计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2；并且，所述上游特异性引物组2相比所述上游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点，所述下游特异性引物组2相比所述下游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点；所述上游特异性引物组2和所述下游特异性引物组2的5’端含有用于高通量测序文库的接头序列；(e)将所述上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2混合后，使用两端的通用引物进行扩增，得到可上机测序的文库。...

【技术特征摘要】
1.一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法，所述文库用于通过高通量测序进行无创产前胎儿β型地贫基因突变的检测，其特征在于，所述方法包括：(a)对母体外周血游离DNA连接带有特异标签序列和任选的样本标签序列的接头序列；(b)使用预文库扩增引物序列对上一步的连接产物进行预文库扩增，其中所述预文库扩增引物序列与所述接头序列互补结合；(c)将上一步得到的预文库分为上游预文库和下游预文库，分别使用上游特异性引物组1和下游特异性引物组1对所述上游预文库和下游预文库进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，其中，所述上游特异性引物组1包括用于扩增β型地贫基因的上游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1；所述下游特异性引物组1包括用于扩增β型地贫基因的下游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1；(d)对所述上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，分别使用上游特异性引物组2和下游特异性引物组2进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2，其中，所述上游特异性引物组2包括用于扩增β型地贫基因的上游引物组2以及用于计算胎儿游离DNA比例的上游引物组2；所述下游特异性引物组2包括用于扩增β型地贫基因的下游引物组2以及计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2；并且，所述上游特异性引物组2相比所述上游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点，所述下游特异性引物组2相比所述下游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点；所述上游特异性引物组2和所述下游特异性引物组2的5’端含有用于高通量测序文库的接头序列；(e)将所述上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2混合后，使用两端的通用引物进行扩增，得到可上机测序的文库。2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述上游特异性引物组1和下游特异性引物组1的5'端带有用于分离扩增产物的修饰，优选带有生物素修饰。3.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述上游特异性引物组1中针对特定目标位点的引物的3’端，与所述上游特异性引物组2中针对该目标位点的引物的5’端有10-15个碱基的重合；所述下游特异性引物组1中针对特定目标位点的引物的3’端，与所述下游特异性引物组2中针对该目标位点的引物的5’端有10-15个碱基的重合。4.根据权利要求1-3任一项所述的文库构建方法，其特征在于，所述用于扩增β型地贫基因的上游引物组1序列如SEQIDNO：1-7所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1序列如SEQIDNO：8-17所示；所述用于扩增β型地贫基因的下游引物组1序列如SEQIDNO：18-25所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1序列如SEQIDNO：26-35所示；所述用于扩增β型地贫基因的上游引物组2序列如SEQIDNO：36-42所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组2序列如SEQIDNO：43-52所示；所述用于扩增β型地贫基因的下游引物组2序列如SEQIDNO：53-59所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2序列如SEQIDNO：60-69所示。5.一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测方法，其特征在于，所述方法包括对权利要求1-4任一项构建的文库进行高通量测序得到测序读长；然后，根据位点的唯一的特异标签序列的总深度和突变等位基因的深度，计算胎源DNA含量并对地贫相关的突变进行分型以分析β...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓锋，曾华萍，宋卓，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43