本发明专利技术涉及一种长片段末端文库的构建方法，包括有1）DNA随机打断、末端缺口补齐修复；2）制成A-Fragment步骤；3）将A-Fragment与LMP?Adaptor进行粘性末端的连接；4）将LMP-Adaptor-Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化；5）将获得的酶消化文库中的片段再次进行环化；6）将纯化后的环状分子用LMP?Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成LMP文库的构建。本发明专利技术的建库方法，只需要合成两条63?bp的寡核苷酸序列，进行简单的分子生物学连接、扩增等实验，获得的LMP文库两端带有测序引物序列，能够直接应用于二代测序。此外，由于二次环化后的片段中存在已知的限制性内切酶位点，能够快速分拣待测片段两端的序列，对测序数据进行有效筛选，去除嵌和序列。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学测序
，具体涉及一种长片段末端文库(Long MatePair，LMP)的构建方法，以及该方法在基因组序列拼接，特别是de novo测序与组装中的有效应用。
技术介绍
目前，二代测序方法已广泛的应用于基因组denovo拼接中，由于测序数据巨大且测序长度短，影响拼接质量的关键因素是基因组的重复序列(如微卫星序列，核糖体RNA序列，转座子序列等)，重复单元的长度在几bp到几kb不等。构建多种不同长度插入片段的文库进行测序，可以跨越不同长度的重复序列，有效地改善基因组的拼接完整性和准确性。LMP基于基因组中较大跨度(2 IOkb)片段两端序列的测序，解决大基因组和复杂基因组的组装问题，纠正重复序列造成的拼接错误，并能够发现基因组的结构变异，特别适用于新基因组测序(De novo sequencing)。目前,几种(long mate pair文库构建的方法存在效率较低，实验过程复杂，不易控制，错误率较高，嵌合分子以及低文库复杂性等缺点。因此，简单有效的LMP方法对于新一代测序技术的发展与应用具有重要作用，但是目前仍然处于改善与探索的过程中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种长片段末端文库构建的方法，可以有效的减少文库构建的步骤，缩短文库构建的时间，提高文库构建的效率，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的方法，其步骤如下I)首先将基因组DNA随机打断，并将打断的DNA进行末端缺口补齐修复；2)将修复的DNA片段的3'端加上脱氧腺苷酸A，制成A-Fragment ；3)将制成A-Fragment与3'端带有突出的脱氧胸甘酸T的LMP Adaptor进行粘性末端的连接，获得环状的LMP-Adaptor-Fragment ；4)将去除了未环化的线性分子的LMP-Adaptor-Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化adaptor以外的区域，获得相应的酶消化文库；5)将步骤4)获得的酶消化文库中的片段进行末端缺口补齐修复后，按照步骤3)再次进行环化；6)将步骤5)获得的环化产物用核酸外切酶消化去除未环化的线性分子；用纯化后的环状分子作为模版，LMP Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成LMP文库的构建。上述步骤I)将打断的DNA进行末端缺口补齐修复是用T4 DNA polymerase来进行的；步骤4)中所述的识别四个碱基的限制性内切酶为Hha I、Nla 111,Hpa II、Mse I或MluC I。步骤6)中所述的LMP Adaptor的引物的序列为SEQ ID NO: I和2。本专利技术的建库方法，只需要合成两条63 bp的寡核苷酸序列，进行简单的分子生物学连接、扩增等实验，获得的LMP文库两端带 有测序引物序列，能够直接应用于二代测序。此外，由于二次环化后的片段中存在已知的限制性内切酶位点，能够快速分拣待测片段两端的序列，对测序数据进行有效筛选，去除嵌和序列。整个过程成本低，步骤简单，易于操作，重现性好。具体实施例方式现结合实施例对本专利技术做进一步详细说明，实施例仅限于说明本专利技术，而非对本专利技术的限定。实施例I LMP文库的构建I)首先将基因组DNA随机打断，并将打断的DNA进行末端缺口补齐修复；首先将提取的基因组DNA用I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，Qubit(Invitrogen)进行定量定性分析，保证DNA的高质量，包括完整性和纯度。然后，取120 μ I基因组DNA(20-35 ng/μ 1)，用CovarisS220进行片段打碎，具体条件如下7°C，mini bluetube, Duty Factor 20%, Peak Incident Power 3ff, cycles per Burst 1000,900 秒。超声打碎完成后，用I. 2%琼脂糖凝胶电泳对2 Kb目的区域进行回收，对回收片段用T4 DNApolymerase进行末端修复，200 μ I体系包含如下的组分100 μ I回收的2 Kb DNA片段，10 mM dNTP 8 μ I, T4 DNA polymerase (3 U/μI) 5 μ I, PNK (poly nucleotidekinase) (10 U/μ I) I. 5 μ I ； Klenow 片段(5 U/μ 1)3 μ 1,10 mM ATP 20 μ 1，IXPNK缓冲液，20°C，反应30分钟，修复完成后的产物用Qiagen PCR cleanup kit进行纯化；2)将修复的DNA片段的3 ^端加上脱氧腺苷酸A，制成A-Fragment ；将纯化后的修复片段的'端加单个“A”碱基，100 μ I体系10 mM dATP I. 5 μ I,Klenow polymerase (exo_) (5 U/μ 1)2 μ I, IXNEB Buffer 2,37°C温育 30 min,随后用 Qiagen PCR cleanup kit 进行纯化，获得 2kb Fragment-Α 基因文库；3)将制成A-Fragment与3'端带有突出的脱氧胸甘酸T的LMP Adaptor进行粘性末端的连接，获得环状的LMP-Adaptor-Fragment ；将Fragment-A基因组文库与带有3 '端T突出的LMP Adaptor用T4 DNA连接酶于12°C孵育过夜，再用Qiagen PCR cleanup kit进行片段纯化，获得环状的LMP-Adaptor-Fragment文库，其中LMP Adaptor的正反序列如下5' pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3' TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAG-p-5，4)将去除了未环化的线性分子的LMP-Adaptor-Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化adaptor以外的区域，获得相应的酶消化文库将获得的环状LMP-Adaptor-Fragment文库先后用T7核酸外切酶(T7exonuclease)和SI核酸酶(SI nuclease)进行消化,除去未环化的线性分子，具体步骤如下环状的 LMP-Adaptor-Fragment 文库 100 μ I ( 500 ng),T7 exonuclease (10 U/μ I)6 μ I, IX反应缓冲液25 μ I，总体积250 μ I，37 °C消化30分钟，70 V热激20分钟使酶失活，立刻冰浴；接着，T7 exonuclease消化后的DNA片段250 μ 1，3M NaCl 8. 25 μ 1，SInuclease (25 U/μ 1)10 μ I, 37°C 消化 30 分钟，Qiagen PCR cleanup kit 进行片段纯化；将纯化后的环状分子均分为两份，分别用Hpa II和Mse I两种限制性内切酶37°C消化2小时，I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，获得片段主要集中Ikb以下，Caliper LabChip XTDNA750 Kit进行300 500bp区域回收；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种长片段末端文库的构建方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：1）首先将基因组DNA随机打断，并将打断的DNA进行末端缺口补齐修复；2）将修复的DNA片段的3′端加上脱氧腺苷酸A，制成A？Fragment；3）将制成A？Fragment与3′端带有突出的脱氧胸甘酸T的？LMP？Adaptor进行粘性末端的连接，获得环状的LMP？Adaptor？Fragment；4）将去除了未环化的线性分子的LMP？Adaptor？Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化adaptor以外的区域，获得相应的酶消化文库；？？？5）将步骤4）获得的酶消化文库中的片段进行末端缺口补齐修复后，按照步骤3）再次进行环化；6）将步骤5）获得的环化产物用核酸外切酶消化去除未环化的线性分子；用纯化后的环状分子作为模版，LMP？Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成长片段末端文库的构建。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈祖耕，姜楠，王萍，暴云娟，刘桂友，陈晓云，
申请(专利权)人：天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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