新型ＤＮＡ片段与含有该片段的重组载体、利用它们转化得到的转化体以及它们的应用制造技术

本发明专利技术涉及单独含有特定基因调节区域的ＤＮＡ片段、或含有该基因调节区域与编码信号肽的基因的ＤＮＡ片段、含有该ＤＮＡ片段的重组载体、含有该重组载体的转化体以及使用该转化体制备重组蛋白质的方法。根据本发明专利技术，可以与重组蛋白质的种类无关地大量且有效地生产蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于生产重组蛋白质的、具有调节转录的碱基序列与编码信号肽的碱 基序列的DNA片段和含有该片段的重组载体、利用它们转化得到的转化体以及它们的应 用。需要说明的是，作为相关申请的相互参考，本申请要求2007年7月13日提出的日本专 利申请2007-183934号的优先权，其全部记载作为公开特别援引于此。
技术介绍
随着近年来遗传工程学的进步，能利用各种生物体作为宿主细胞生产蛋白质。特 别是熟知将含有外来基因的重组载体导入宿主细胞的宿主_载体系统。如果使用宿主_载 体系统，则可以在不将外来基因插入宿主细胞的染色体的情况下获得重组蛋白质。作为宿主-载体系统中的宿主细胞而广泛使用的是大肠杆菌(Escherichia coil)(例如参见日本专利2988951号公报以及作为其同族专利的欧州0441361号公报与美 国5304471号公报(以下，有时将它们称为专利文献1)，上述专利的全部记载作为公开特别 援引于此)。大肠杆菌中，传代时间短至约为20分钟，可以将各种糖类同化并增殖。并且， 正在开发适合大肠杆菌的大量质粒载体，以大肠杆菌为宿主细胞的宿主-载体系统实现重 组蛋白质的迅速且稳定的工业生产。但是，由于大肠杆菌的在菌体内蓄积重组蛋白质的性质，存在下述对于大量且稳 定生产重组蛋白质不利的方面抑制大肠杆菌本身的生育，并且在菌体内的蛋白质分解酶 (蛋白酶)的作用下，重组蛋白质的功能容易丧失。并且，为了获得重组蛋白质而必须将菌 体回收，破碎，并且非常小心翼翼地除去作为发热性物质之一的脂多糖。因此，也产生了导 致用于收集 纯化重组蛋白质的工序变复杂的问题。为此，为了解决上述问题，目前为止正研究利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的宿主-载体系统。枯草芽孢杆菌的传代时间约为30分钟，与大肠杆菌基本相 同，能将蛋白质分泌到菌体外，并且不含有脂多糖作为菌体构成成分。因此，若与使用大肠 杆菌的宿主_载体系统相比较，使用枯草芽孢杆菌的宿主_载体系统具有可以大量且稳定 地生产重组蛋白质，并且可以容易地收集 纯化重组蛋白质的优点。例如，作为利用以上述枯草芽孢杆菌为宿主的宿主_载体系统生产重组蛋白质的 例子，报导了将来自化脓性链球菌(StreptococcuspyoRenes)株的链丝菌素0基因导入 表达载体，利用所得的重组载体转化枯草芽孢杆菌，由此可以由培养上清液得到链丝菌素 0(参见日本特开平05-184372号公报(以下，有时也称为专利文献2)，其全部记载作为公 开特别援引于此)。
技术实现思路
专利技术所需解决的课题但是，根据本专利技术人的研究，在使用枯草芽孢杆菌的宿主-载体系统中，根据重组蛋白质的种类，有时重组载体上的调节转录的碱基序列(以下称为“基因调节区域”)基于 某种原因而不能正常发挥功能。为此，明确了存在抑制重组蛋白质表达的问题。另外，还 明确了即使基因调节区域正常发挥功能，在编码信号肽的碱基序列(以下称为“信号肽基 因”)不发挥功能，或者基因调节区域与信号肽基因的组合不适当的情况下，也存在重组蛋 白质以容易受到蛋白酶等的分解的状态残留在细胞内或细胞膜内等问题。为此，明白了解决上述问题的宿主-载体系统的确立对于以枯草芽孢杆菌为宿主 生产重组蛋白质是必须的，所述宿主-载体系统可以与重组蛋白质种类无关地大量表达重 组蛋白质基因并有效分泌到细胞外。因此，本专利技术的第一目的在于提供在以枯草芽孢杆菌为宿主的系统中，可以与重 组蛋白质的种类无关地大量且有效生产蛋白质的新方法。更具体而言，在于提供可以与重 组蛋白质的种类无关地大量表达重组蛋白质的含有基因调节区域的DNA片段。此外，还在 于提供可以有效地将重组蛋白质分泌到细胞外的含有基因调节区域与信号肽基因的组合 的DNA片段。并且，还在于提供使编码重组蛋白质的碱基序列(以下，称为“重组蛋白质基 因”)连接于基因调节区域或基因调节区域与信号肽基因的下游而得到的DNA片段。本专利技术的第二目的在于提供含有上述DNA片段的重组载体、利用它们转化的转化 体以及利用它们的重组蛋白质的制备方法。用于解决课题的手段本申请专利技术人进行了潜心研究，结果克隆了保藏号为FERM AP-20227的芽孢杆菌 TAMB750 (Bacillus sp. JAMB750)株所具有的基因调节区域。进而，为了提高信号肽的分泌 性能，重新设计了信号肽。其结果是，发现如果在含有它们的DNA片段的下游结合重组蛋白 质的结构基因，将其插入于适当的载体后导入枯草芽孢杆菌，则可以与蛋白质的种类无关 地大量生产该重组蛋白质并且有效地分泌到细胞外，从而完成本专利技术。S卩，根据本专利技术，能提供含有下述(a)-(c)的任一碱基序列、能促进存在于其下游 的基因的表达的DNA片段。(a)序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列中，缺 失、置换、倒位或添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由序列表的SEQ IDN0 1或2所记载的碱 基序列和与其互补的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交。进而，根据本专利技术，能提供含有下述(a)-(c)的任一碱基序列、能促进存在于其下 游的基因的表达并且将该基因的基因产物分泌到细胞外的DNA片段。(a)下述碱基序列，其包含序列表的SEQ ID NO 1或2所记载的碱基序列与直接 或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在包含序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列 与直接或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列的碱基序列中，缺失、置换、倒位或 添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由下述碱基序列和与其互补的碱基序列构 成的DNA在严格条件下杂交，所述碱基序列包含序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基 序列与直接或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列。5进而，根据本专利技术，提供含有下述(a)-(c)的任一碱基序列、能促进存在于其下游 的基因的表达并且将该基因的基因产物分泌到细胞外的DNA片段。(a)下述碱基序列，其包含序列表的SEQ ID NO 1或2所记载的碱基序列与直接 或间接地连接于其下游的编码SEQ ID NO 3所记载的氨基酸序列；(b)如下得到的碱基序列在包含序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列 与直接或间接地连接于其下游的编码SEQ IDN0 3所记载的氨基酸序列的碱基序列的碱基 序列中，缺失、置换、倒位或添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由下述碱基序列和与其互补的碱基序列构 成的DNA在严格条件下杂交，所述碱基包含序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列 与直接或间接地连接于其下游的编码SEQ ID NO :3所记载的氨基酸序列的碱基序列。进而，根据本专利技术，能提供含有上述含基因调节区域的本专利技术DNA片段的碱基序 列与直接或间接地连接于其下游的编码重组蛋白质的碱基序列的DNA片段、以及含有上述 含基因调节区域与肽基因的本专利技术DNA片段的碱基序列与直接连接于其下游的编码重组 蛋白质的碱基序列的DNA片段。优选上述重组蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＤＮＡ片段，其含有下述（ａ）－（ｃ）的任一碱基序列，能促进存在于其下游的基因的表达：（ａ）序列表的ＳＥＱＩＤＮＯ：１或２所记载的碱基序列；（ｂ）如下得到的碱基序列：在序列表的ＳＥＱＩＤＮＯ：１或２所记载的碱基序列中，缺失、置换、倒位或添加１个或多个碱基；或（ｃ）下述ＤＮＡ的碱基序列，所述ＤＮＡ能与由序列表的ＳＥＱＩＤＮＯ：１或２所记载的碱基序列和与其互补的碱基序列构成的ＤＮＡ在严格条件下杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-7-13 183934/2007DNA片段，其含有下述(a)-(c)的任一碱基序列，能促进存在于其下游的基因的表达(a)序列表的SEQ ID NO1或2所记载的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在序列表的SEQ ID NO1或2所记载的碱基序列中，缺失、置换、倒位或添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由序列表的SEQ IDNO1或2所记载的碱基序列和与其互补的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交。2.DNA片段，其含有下述(a)-(c)的任一碱基序列，能促进存在于其下游的基因的表 达，并且将该基因的基因产物分泌到细胞外(a)下述碱基序列，其包含序列表的SEQID NO :1或2所记载的碱基序列与直接或间 接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在包含序列表的SEQID NO :1或2所记载的碱基序列与直 接或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列的碱基序列中，缺失、置换、倒位或添加 1个或多个碱基而得到的碱基序列；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由下述碱基序列和与其互补的碱基序列构成 的DNA在严格条件下杂交，所述碱基序列包含序列表的SEQ ID NO 1或2所记载的碱基序 列与直接或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列。3.DNA片段，其含有下述(a)-(c)的任一碱基序列，促进存在于其下游的基因的表达， 并且能将该基因的基因产物分泌到细胞外(a)下述碱基序列，其包含序列表的SEQID NO :1或2所记载的碱基序列与直接或间 接地连接于其下游的编码SEQ ID NO :3所记载的氨基酸序列的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在包含序列表的SEQID NO :1或2所记载的碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦田勇二，大田优佳莉，日高祐子，中村信之，
申请(专利权)人：独立行政法人海洋研究开发机构，
类型：发明
国别省市：JP[日本]