新的细胞外分泌型核酸酶制造技术

本发明专利技术的目的在于提供由天然的非病原性微生物分泌到细胞外且比活性比现有核酸酶的比活性高、在工业性规模的核酸分解中有用的核酸酶。上述目的通过一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶来实现，其以双链DNA、单链DNA和RNA为底物，并且纯化后在含有1mM MgCl2和1mM CaCl2、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟时的比活性与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的细胞外分泌型核酸酶、其制造方法及该制造方法中使用的新的链霉菌属细菌。另外，本专利技术涉及使用该细胞外分泌型核酸酶的分解核酸的方法。
技术介绍
核酸酶(Nuclease)是特异性地分解核酸的核酸分解酶的总称。使核酸酶作用于脱氧核糖核酸或核糖核酸等核酸时，核酸中的糖与磷酸之间的磷酸二酯键水解而生成核苷酸。核酸酶被分类为EC编号(Enzyme Commission numbers,酶学委员会编号)为EC.3.1的酯水解酶的一种。另外，核酸酶除了分类为分解RNA的核糖核酸酶和分解DNA的脱氧核糖核酸酶以外，还可以根据分解的方式进行分类。用于催化从序列中间的内部(endo-)将核酸切断的反应的酶称为核酸内切酶。作为代表性的核酸内切酶，可以列举各种限制性内切酶。与此相对，用于催化以从核酸序列的外侧(exo-)朝向内部、从核酸的5’端或3’端进行切削的方式将核酸切断的反应的酶称为核酸外切酶。作为代表性的核酸外切酶，已知核酸外切酶III等。目前，核酸酶在从研究室规模至工业规模的多种多样的场合中使用。例如，使用核酸酶时，可以利用其核酸分解活性使细胞提取液的粘性降低。因此，分离和纯化细胞提取液中的蛋白质及其他目标物质时，如果使用核酸酶，则可以期待缩短工艺时间、提高目标物质的收量、改善利用离心分离法的分级(颗粒与上清的分离性)、使溶液的过滤(特别是超滤)顺畅、提高层析工艺的效率等。另外，如果在分离和纯化核酸所非特异性吸附的病毒或包涵体等时使用核酸酶，则可以期待使它们的收率提高。此外，如果在用于分析生物试样的ELISA、层析、2D-PAGE或足迹分析等样品制备中使用核酸酶，则能够避免不期望的由核酸引起的测定误差。作为这样的能够在各种规模和场合下使用的核酸酶，已知来源于沙雷氏菌(Serratia spp.)的核酸内切酶(分别参考作为专利文献I和2的日本专利第2604365号说明书和美国专利第5173418号说明书，专利文献I和2的记载作为公开的内容特别援引于此)。沙雷氏菌属微生物中，有作为机会感染菌而具有病原性的微生物。因此，专利文献I中记载的核酸内切酶利用基因重组技术使用大肠杆菌以分泌到细胞外的细胞外分泌型酶的形式制造。另外，专利文献I中记载的来源于沙雷氏菌的核酸内切酶以 >'/少一S (注册商标)的商品名市售(参考作为非专利文献I的“ O '/ f —七二二一々々工> K ^夕> 7 一七(> '/ f 一七独特的核酸内切酶)”、 ,2008年I月I日、々株式会社、、 互联网 <URL:http://www2.merck.c0.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Ben zonase_16p.pdf>,非专利文献I的记载作为公开的内容特别援引于此)。作为非病原性微生物来源的核酸酶，已知放线菌的一种链霉菌属细菌(Streptomyces spp.)产生的核酸酶(分别参考作为非专利文献2 7的Biochem.J.1995306, 93-100 ；Biochem.J.1992 281, 231-237 ；Appl Microbiol Biotechnol.1995Nov;43(6):1056-1060 ；Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects, Volumel721, Issuesl-3, 18January2005, 116-123 ；FEMS Microbiology Letters, Volume237, Issue2, 15August2004,273-278 和 Process Biochemistry Volume40,Issues3_4, March2005, 1271-1278，非专利文献2 7的记载作为公开的内容特别援引于此)。非专利文献2和3中记载的核酸酶以细胞内蓄积型酶的形式生产。与此相对，非专利文献4 7中记载的核酸酶为分泌到细胞外的细胞外分泌型酶。现有技术 文献专利文献专利文献1:日本专利第2604365号说明书专利文献2:美国专利第5173418号说明书非专利文献非专利文献1:“<>'/ f 一七二二一夕々工 > K ^ ” > 7* —七 ”、 ,2008年I月I日、J卟夕株式会社、、互联网<URL:http://www2.merck.c0.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Benzonase_16p.pdf>非专利文献2:Santiago CAL, Jesus F.APARIC10, Clara G.DE LOSREYES-GAVILAN, Rebeca G.NICIEZA and Jesus SANCHEZ, Biochem.J.1995 306，93-100非专利文献3:Jesus F.APARIC10, Carlos HARD ISSON and JesusSANCHEZ, Biochem.J.1992 281，231-237非专利文献4:Vukelic B, Ritonja A, Vitale L., ApplMicrobiolBiotechnol.1995 年 11 月;43(6):1056-1060.非专利文献 5:Zuzana Brnakova, Andrej Godany and JozefTimko, Biochimicaet Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, Volumel721, Issuesl-3, 2005 年 I 月 18日，116-123非专利文献6:Sumedha S.Deshmukh and Vepatu Shankar, FEMS MicrobiologyLetters, Volume237, Issue2, 2004 年 8 月 15 日，273-278 页非专利文献7:Nitin S.Patil, Sumedha S.Deshmukh andVepatu Shankar, ProcessBiochemistry Volume40, Issues3_4, 2005 年 3 月，1271-1278 页
技术实现思路
专利技术所要解决的问题专利文献I和2中记载的核酸酶以及非专利文献I中记载的 > '/ t — 是使用非病原性微生物制造的核酸酶。但是，由于这些核酸酶利用基因重组大肠杆菌进行生产，因此，生产率低于来源微生物的生产率。因此，为了得到工业性规模的核酸酶，需要重复或延长生产步骤等，操作方面、经济方面和时间上的负担的增大成为问题。因此，作为核酸酶的生产方法，期望不使用基因重组技术而使用天然的非病原性微生物进行生产。非专利文献2和3中记载的核酸酶是蓄积在非病原性微生物体内的细胞内蓄积型酶。因此，为了得到这些核酸酶，必须将蓄积有核酸酶的微生物体破碎、接着从得到的微生物破碎物中分离纯化核酸酶。因此，得到非专利文献2和3中记载的核酸酶的工艺复杂，并且存在混入杂质的可能性高的问题。与此相对，非专利文献4 7中记载的核酸酶是分泌到非病原性微生物的体外的细胞外分泌型酶，不会引起制造上述的专本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶，其以双链DNA、单链DNA和RNA为底物，并且纯化后在含有1mM MgCl2和1mM CaCl2、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟时的比活性与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：森梢，大田优佳莉，秦田勇二，中村信之，宫崎征行，
申请(专利权)人：独立行政法人海洋研究开发机构，
类型：发明
国别省市：日本;JP