核糖核酸内切酶组合物及其使用方法技术

本发明专利技术提供了变体Csy4核糖核酸内切酶、编码所述变体Csy4核糖核酸内切酶的核酸以及经所述核酸遗传修饰的宿主细胞。也提供了所述变体Csy4核糖核酸内切酶用于多种应用。本发明专利技术也提供了检测靶多核糖核苷酸中特定序列的方法；以及调节真核细胞中靶RNA的生成的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核糖核酸内切酶组合物及其使用方法交叉引用该申请要求2010年5月10日提交的美国临时专利申请号61/333,163；2010年7月19日提交的美国临时专利申请号61/365,627；以及2010年11月12日提交的美国临时专利申请号61/413,287的权益，这些申请各自以引用方式全部并入本文。关于政府赞助研究的声明该专利技术是根据美国国立卫生研究院授予的拨款号T32GM07232和美国国家科学基金会授予的拨款号MCB-0950971的政府支持下进行的。政府具有本专利技术的某些权利。专利技术背景在二十世纪七十年代，DNA限制酶通过使随意裂解特定DNA序列成为可能而改变了分子生物学。目前RNA分子的测序必需将RNA拷贝进DNA链，然后通过常规方法来对所述DNA链进行测序。该方法也称为RNASeq，其有效并且可产生数百万个序列读数。然而，由于个别步骤的序列依赖性功效，产生cDNA的必要性导致固有偏好。文献Carte等(2008)GenesDev.22：3489；美国专利公开号2010/0093026。专利技术概要本公开提供了变体Csy4核糖核酸内切酶、编码变体Csy4核糖核酸内切酶的核酸以及经所述核酸遗传修饰的宿主细胞。也提供了变体Csy4核糖核酸内切酶用于多种应用。本公开也提供了检测靶多核糖核苷酸中特定序列的方法；以及调节真核细胞中靶RNA的生成的方法。附图简述图1A-C示出Pal4Csy4对前体-crRNA(pre-crRNA)底物的特异性识别。示出的核苷酸序列是5′-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3′(SEQIDNO：1)。图2A-C示出结合RNA底物的Csy4的晶体结构。图3A和3B示出：Csy4的催化中心的详细视图(图3A)；以及Csy4野生型(WT)和突变体的裂解活性(图3B)。图4示出12个Csy4序列中不变的氨基酸。Pa(SEQIDNO：8)；Yp(SEQIDNO：34)；Ec89(SEQIDNO：39)；Dn(SEQIDNO：79)；Ab(SEQIDNO：84)；MP1(SEQIDNO：2)；MP01(SEQIDNO：3)；SW(SEQIDNO：4)；Pm(SEQIDNO：85)；Pw(SEQIDNO：13)；和Dd(SEQIDNO：10)。图5A-5BD展示各种Csy4多肽的氨基酸序列比对以及由各Csy4多肽识别的RNA序列的核苷酸序列。图6示出无酶活性、序列特异性核糖核酸内切酶的氨基酸序列的例子。图7示出检测靶多核糖核苷酸中特定序列的方法的例子。图8示出咪唑对各种无酶活性的Csy4变体的活化的作用。图9示出分离靶RNA的示例性方法。示出Csy4靶茎-环(SEQIDNO：103)。图10示出调节真核细胞中靶RNA的表达的示例性方法。示出Csy4RNA底物序列(SEQIDNO：103)。定义如本文所使用，“多核糖核苷酸”是指核苷酸的聚合形式，并且包括RNA、包含脱氧核苷酸的RNA以及包含核苷酸的DNA。在一些情况下，多核糖核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸(例如，脱氧肌苷、脱氧尿苷或羟甲基脱氧尿苷)。在一些情况下，多核糖核苷酸仅由核苷酸组成(即，不包括任何脱氧核苷酸)。在一些情况下，多核糖核苷酸包含核苷酸，以及一种或多种修饰的核苷酸，但不包括任何脱氧核苷酸。在其他情况下，多核糖核苷酸包含核苷酸，并且可包含一种或多种修饰的核苷酸，以及一种或多种脱氧核苷酸(包括修饰的脱氧核苷酸)。在一些情况下，其中多核糖核苷酸包含一种或多种脱氧核苷酸，脱氧核苷酸占多核糖核苷酸中总核苷酸的约50％至约40％、约40％至约30％、约30％至约20％、约20％至约10％、约10％至约1％或者小于1％。术语“核酸”和“多核苷酸”可交换使用并且指任意长度的核苷酸(脱氧核苷酸或核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性例子包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、载体、探针和引物。“生物样本”涵盖从细胞、细胞外物质、组织或多细胞生物体中获得的多种样本类型。定义涵盖血液和生物来源的其他液体样本、固体组织样本，例如活检标本或组织培养物或者由其衍生的细胞及其子代。定义也包括在采购后以任何方式进行操作的样本，所述方式例如通过使用试剂处理、溶解或富集某些组分诸如多核苷酸。术语“生物样本”涵盖临床样本，并且也包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体(例如，脑脊液、支气管肺泡灌洗液、尿液、血液、血液部分(例如，血浆、血清)、痰等)以及组织样本。在一些情况下，生物样本包括细胞。在其他情况下，生物样本无细胞。术语“可操作连接”是指在分子之间功能性连接以提供期望的功能。在核酸的情况中，“可操作连接”是指核酸之间的功能性连接以提供期望的功能，诸如转录、翻译等，例如，在核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)和第二多核苷酸之间的功能性连接，其中表达控制序列影响第二多核苷酸的转录和/或翻译。在多肽的情况中，“可操作连接”是指在(例如，不同结构域的)氨基酸序列之间的功能性连接以提供多肽的所述活性。“分离的”是指(如果天然存在)在与其天然存在的环境不同的环境中的蛋白质或核酸。“分离的”意思为包括在样本内的蛋白质或核酸，该样本基本上富含目标蛋白质或核酸和/或其中目标蛋白质或核酸是部分或基本上纯的。在其中蛋白质或核酸不是天然存在的情况中，“分离的”表示已经将蛋白质或核酸通过合成或重组方式从其制备的环境中分离。“基本上纯的”表示实体(例如，多肽或核酸)构成组合物的总含量(例如，组合物的总蛋白)的大于约50％并且通常总蛋白含量的大于约60％。在一些实施方案中，“基本上纯的”是指其中总组合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多为目标实体(例如总蛋白的95％)的组合物。在一些实施方案中，目标蛋白质或核酸将构成组合物中总蛋白质或核酸的大于约90％、大于约95％、大于约98％或大于约99％。在进一步描述本专利技术之前，应理解，本专利技术不受描述的具体实施方案限制，因为其当然可变化。也应理解，本文所使用的术语的目的仅仅是为了描述具体实施方案，而不是旨在限制，因为本专利技术的范围仅受所附权利要求的限制。在其中提供大量数值的情况中，应理解，除非上下文中明确另有说明，该范围和任何其他所述范围的上下限之间的下限单位的十分之一的各居中值或者在所述范围中居中值涵盖在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本专利技术内，服从在所述范围中任何具体排除限制。在其中所述范围包括限值的一个或两者的情况中，排除一个或两个这些包括的限值的范围也包括在本专利技术中。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本专利技术的实践或测试中也可使用与本文所述类似或等同的任何方法和材料，但现描述优选的方法和材料。本文所提及的所有出版物以引用的方式并入本文以公开和描述关于其这些出版物被引用的方法和/或材料。必须注意的是，除非上下文中明确另有说明，如本文所使用以及在所附权利要求中，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数参照对象。因此，例如，参照“位点特异性核糖核酸内切酶”包括多种此类位点特异性核糖核酸内切酶以及参照本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.10 US 61/333,163;2010.07.19 US 61/365,627;1.一种变体Csy4核糖核酸内切酶，其由SEQIDNO：101所示氨基酸序列组成，其中在缺乏咪唑时，所述变体Csy4核糖核酸内切酶无酶活性，以及其中在咪唑存在下，所述变体Csy4核糖核酸内切酶可活化；和/或其中所述变体核糖核酸内切酶结合但不切割该变体核糖核酸内切酶的RNA底物。2.根据权利要求1所述的变体Csy4核糖核酸内切酶，其中所述变体Csy4核糖核酸内切酶包含提供可检测信号的部分。3.根据权利要求2所述的变体Csy4核糖核酸内切酶，其中所述提供可检测信号的部分是荧光团、量子点、除所述核糖核酸内切酶之外的酶或者纳米粒子。4.根据权利要求1所述的变体Csy4核糖核酸内切酶，其中所述核糖核酸内切酶被固定在不溶性支撑物上。5.根据权利要求4所述的变体Csy4核糖核酸内切酶，其中所述不溶性支撑物是小珠。6.根据权利要求1所述的变体Csy4核糖核酸内切酶，其中所述变体Csy4核糖核酸内切酶结合包含核苷酸序列5'-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3'(SEQIDNO:l)的RNA底物。7.一种由编码根据权利要求1所述的变体Csy4核糖核酸内切酶的核苷酸序列组成的核酸。8.一种包含根据权利要求7所述的核酸的重组载体。9.根据权利要求8所述的重组载体，其为重组克隆载体或重组表达载体。10.一种包含编码根据权利要求1所述的变体Csy4核糖核酸内切酶的核苷酸序列的重组表达载体。11.根据权利要求10所述的重组表达载体，其中编码所述变体Csy4核糖核酸内切酶的所述核苷酸序列可操作连接至启动子。12.根据权利要求11所述的重组表达载体，其中所述启动子是诱导型启动子。13.一种包含根据权利要求10所述的重组表达载体的体外遗传修饰的宿主细胞。14.一种用于纯化核酸的混合群中存在的靶RNA的试剂盒，所述试剂盒包含：根据权利要求1所述的变体Csy4核糖核酸内切酶。15.根据权利要求14所述的试剂盒，进一步包含重组表达载体，所述重组表达载体以5'至3'的顺序和可操作连接包含：a)编码由根据权利要求1所述的变体Csy4核糖核酸内切酶特异性结合的RNA底物序列5'-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3'(SEQIDNO:1)的核苷酸序列；和b)适合插入编码所述靶RNA的核酸的多克隆位点。16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中编码所述RNA底物的所述核苷酸序列可操作连接至启动子。17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述启动子是诱导型启动子。18.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述重组表达载体包含编码所述靶RNA的核苷酸序列，所述核苷酸序列插入所述多克隆位点。19.根据权利要求14所述的试剂盒，进一步包含咪唑。20.根据权利要求14所述的试剂盒，进一步包含一种或多种洗涤缓冲剂。21.根据权利要求14所述的试剂盒，进一步包含阳性对照表达载体。22.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述变体Csy4核糖核酸内切酶被固定在不溶性支撑物上。23.一种分离核酸的混合群中存在的靶RNA的方法，所述方法包括：a)使核酸的混合群与根据权利要求1所述的变体Csy4核糖核酸内切酶接触，其中所述变体Csy4核糖核酸内切酶被固定在不溶性支撑...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·E·赫维兹，J·A·杜娜，B·维登赫夫特，M·伊内克，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：
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