在细胞中稳定保持外来基因的方法技术

本发明专利技术涉及使外来基因表达来制备上述外来基因所编码的蛋白或肽的方法，该方法包括：在可以表达的状态下插入任意外来基因，以准备在可以表达的状态下具有编码氨酰ｔＲＮＡ合成酶的基因的重组载体的步骤；准备使编码氨酰ｔＲＮＡ合成酶的染色体基因缺失的突变宿主细胞等的步骤；用重组载体转化突变宿主细胞得到转化体的步骤；培养转化体，以制备上述外来基因所编码的蛋白或肽的步骤。根据本发明专利技术，可以提供：在不使用抗生素、且对培养基组成没有限制的情况下能够在宿主细胞中维持重组ＤＮＡ克隆载体的新手段；和利用该手段来制备外来基因所编码的蛋白或肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。更详细而言，本专利技术涉及该方法 中使用的、包含编码氨酰tRNA合成酶的基因的重组载体、用于表达编码氨酰tRNA合成酶的 基因以外的任意外来基因的突变宿主细胞、以及表达编码氨酰tRNA合成酶的基因以外的 外来基因来制备上述外来基因所编码的蛋白或肽的方法。需要说明的是，作为相关申请的 相互参照，本申请主张2007年7月13日申请的日本特愿2007-1839831号的优先权，其全 部内容作为公开而特别引用于此。
技术介绍
将重组DNA技术应用于实际中，并尝试着利用所得的转化细胞来生产目标分子 时，通常转化细胞内的染色体外基因(即其中所含的目标外来基因)的存在极不稳定，产生 非常难以生产目标分子的问题。实验室中通常所用的克隆和表达载体通常是多拷贝重组载体，通过每个细胞基因 组的多个重组载体来确保向其后代稳定遗传。但是，向这些重组载体中导入外来基因会给 细胞的增殖循环期间带来各种程度的不稳定性。在工业生产步骤中，有时需要1000L培养 物，需要50世代以上的世代交替后的IO16个以上的细胞。因此，为了确保细胞中重组载体 的存在、进而确保外来基因的表达，人们希望使细胞中的重组载体稳定直至发酵槽内的培 养结束。已知有几种使携带外来基因的重组载体在细胞中稳定的方法。其中的一种方法包含以下内容先使抗生素耐性基因包含在重组载体中，之后向 培养基中加入适当的抗生素。保持有含抗生素耐性基因的重组载体的细胞被筛选，未保持 该重组载体的细胞不被筛选而被排除。通过插入抗生素耐性基因使重组载体稳定，这通常在实验室中进行，但由于下述 理由，在工业规模的生产中并不优选。(i)使用抗生素耐性菌株有可能给环境带来危险。(ii)培养中所必需的抗生素量使生产成本显著增加。(iii)在用于人和动物的物质的生产中应避免使用抗生素。补充染色体的营养要求突然突变的方法也是已知的重组载体稳定化方法之一 (参照Genetics. 1989 May ； 122(1) 19 27 (以下，有时还称作非专利文献1)和Curr Genet. 1989 Sep ； 16 (3) 159 63 (以下，有时还称作非专利文献2)，这些内容作为公开而 特别引用于此)。在该方法中，必需严格限制发酵培养基的组成，在不向培养基中加入宿主 细菌所必需的营养的情况下进行发酵。而且，通过营养共生，在重组载体消失后细胞仍有可 能增殖。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题如上所述，上述两种筛选方法依赖于培养基的特殊处理。这样的限制会导致发酵 步骤的费用增加、以及为了提高生产率而能够采取的筛选自由度受限。因此，人们迫切希望开发在不使用抗生素、且对培养基组成没有限制的情况下能够维持重组DNA克隆载体的其他筛选方法。因此，本专利技术的目的在于提供在不使用抗生素、且没有限制的情况下能够维持重 组DNA克隆载体的新手段和利用该手段来制备外来基因所编码的蛋白或肽的方法。解决课题的方法本专利技术人等为了解决上述课题进行各种研究，发现根据带有氨酰tRNA合成酶基 因的染色体外基因与使该氨酰tRNA合成酶活性产生缺失的染色体突变宿主细胞的互补 性，在不使用抗生素、且不限制培养基组成的情况下能够维持重组DNA克隆载体，从而完成 了本专利技术。本专利技术基于仅确保含有染色体外基因的细胞生存，所述染色体外基因带有氨酰 tRNA合成酶基因。本专利技术如下。(1)重组载体，该重组载体具有在可以表达的状态下能够插入编码氨酰tRNA合成 酶的基因以外的任意外来基因的位点、且在可以表达的状态下具有编码氨酰tRNA合成酶的基因，上述重组载体在突变宿主中使用，所述突变宿主是使编码氨酰tRNA合成酶的染 色体基因缺失、或者使编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因的表达降低至宿主细胞无法生 长的程度。(2) (1)所述的重组载体，其中氨酰tRNA合成酶为色氨酰tRNA合成酶、丙氨酰 tRNA合成酶、精氨酰tRNA合成酶、天冬酰胺酰tRNA合成酶、天冬氨酰tRNA合成酶、半胱氨 酰tRNA合成酶、谷氨酰胺tRNA合成酶、谷氨酸tRNA合成酶、甘氨酸tRNA合成酶、组氨酰 tRNA合成酶、异亮氨酰tRNA合成酶、亮氨酰tRNA合成酶、赖氨酸tRNA合成酶、甲硫氨酰 tRNA合成酶、苯丙氨酸tRNA合成酶、脯氨酰tRNA合成酶、丝氨酰tRNA合成酶、苏氨酰tRNA 合成酶、酪氨酰tRNA合成酶或缬氨酰tRNA合成酶。(3) (1)或(2)所述的重组载体，该重组载体具有质粒、噬菌体或逆转录转座子的 形态。(4)突变宿主细胞，该突变宿主细胞是使编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因缺 失、或者使编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因的表达降低至宿主细胞无法生长的程度，上述突变宿主细胞经重组载体转化后使用，所述重组载体具有在可以表达的状态 下能够插入编码氨酰tRNA合成酶的基因以外的任意外来基因的位点、且在可以表达的状态下具有编码氨酰tRNA合成酶的基因。(5) (4)所述的突变宿主细胞，其中氨酰tRNA合成酶为色氨酰tRNA合成酶、丙氨 酰tRNA合成酶、精氨酰tRNA合成酶、天冬酰胺酰tRNA合成酶、天冬氨酰tRNA合成酶、半胱 氨酰tRNA合成酶、谷氨酰胺tRNA合成酶、谷氨酸tRNA合成酶、甘氨酸tRNA合成酶、组氨 酰tRNA合成酶、异亮氨酰tRNA合成酶、亮氨酰tRNA合成酶、赖氨酸tRNA合成酶、甲硫氨酰 tRNA合成酶、苯丙氨酸tRNA合成酶、脯氨酰tRNA合成酶、丝氨酰tRNA合成酶、苏氨酰tRNA 合成酶、酪氨酰tRNA合成酶或缬氨酰tRNA合成酶。(6) (4)或(5)所述的突变宿主细胞，其中带有突变的宿主细胞为细菌、酵母、动物细胞或植物细胞。(7) (4)或(5)所述的突变宿主细胞，其中带有突变的宿主细胞为细菌或酵母。(8) (6)或(7)所述的突变宿主细胞，其中细菌为芽孢杆菌属细菌。(9)使编码氨酰tRNA合成酶的基因以外的外来基因表达来制备上述外来基因所编码的蛋白或肽的方法，该方法包括下述步骤准备重组载体的步骤，所述重组载体具有在可以表达的状态下能够插入任意外来 基因的位点、且在可以表达的状态下具有编码氨酰tRNA合成酶的基因，在上述重组载体 的、在可以表达的状态下能够插入任意外来基因的位点插入有期望的外来基因；准备突变宿主细胞的步骤，所述突变宿主细胞是使编码氨酰tRNA合成酶的染色 体基因缺失、或者使编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因的表达降低至宿主细胞无法生长 的程度；用上述重组载体转化上述突变宿主细胞得到转化体的步骤；培养上述转化体来制备上述外来基因所编码的蛋白或肽的步骤。(10)在宿主细胞内稳定维持目标重组载体的方法，该方法包括使上述宿主细胞中所含的、编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因缺失或者使其降 低至宿主细胞无法生长的程度，之后以上述宿主细胞作为突变宿主细胞；使上述目标重组载体在可以表达的状态下含有编码氨酰tRNA合成酶的基因；用在可以表达的状态下含有上述编码氨酰tRNA合成酶的基因的目标重组载体转 化上述突变宿主细胞。(11) (10)所述的方法，其中上述重组载体具有在可以表达的状态下能够插入编码 氨酰tRNA合成酶的基因以外的任意外来基因的位点。(12) (9) (11)中任一项所述的方法，其中氨酰tRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组载体，该重组载体具有在可以表达的状态下能够插入编码氨酰ｔＲＮＡ合成酶的基因以外的任意外来基因的位点、且在可以表达的状态下具有编码氨酰ｔＲＮＡ合成酶的基因，上述重组载体在突变宿主中使用，所述突变宿主是使编码氨酰ｔＲＮＡ合成酶的染色体基因缺失、或者使编码氨酰ｔＲＮＡ合成酶的染色体基因的表达降低至宿主细胞无法生长的程度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-7-13 183931/2007重组载体，该重组载体具有在可以表达的状态下能够插入编码氨酰tRNA合成酶的基因以外的任意外来基因的位点、且在可以表达的状态下具有编码氨酰tRNA合成酶的基因，上述重组载体在突变宿主中使用，所述突变宿主是使编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因缺失、或者使编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因的表达降低至宿主细胞无法生长的程度。2.权利要求1所述的重组载体，其中氨酰tRNA合成酶为色氨酰tRNA合成酶、丙氨 酰tRNA合成酶、精氨酰tRNA合成酶、天冬酰胺酰tRNA合成酶、天冬氨酰tRNA合成酶、半胱 氨酰tRNA合成酶、谷氨酰胺tRNA合成酶、谷氨酸tRNA合成酶、甘氨酸tRNA合成酶、组氨 酰tRNA合成酶、异亮氨酰tRNA合成酶、亮氨酰tRNA合成酶、赖氨酸tRNA合成酶、甲硫氨酰 tRNA合成酶、苯丙氨酸tRNA合成酶、脯氨酰tRNA合成酶、丝氨酰tRNA合成酶、苏氨酰tRNA 合成酶、酪氨酰tRNA合成酶或缬氨酰tRNA合成酶。3.权利要求1或2所述的重组载体，该重组载体具有质粒、噬菌体或逆转录转座子的形态。4.突变宿主细胞，该突变宿主细胞是使编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因缺失、或者 使编码氨酰tRNA合成酶的染色体基因的表达降低至宿主细胞无法生长的程度，上述突变宿主细胞经重组载体转化后使用，所述重组载体具有在可以表达的状态下能 够插入编码氨酰tRNA合成酶的基因以外的任意外来基因的位点、且在可以表达的状态下具有编码氨酰tRNA合成酶的基因。5.权利要求4所述的突变宿主细胞，其中氨酰tRNA合成酶为色氨酰tRNA合成酶、丙 氨酰tRNA合成酶、精氨酰tRNA合成酶、天冬酰胺酰tRNA合成酶、天冬氨酰tRNA合成酶、半 胱氨酰tRNA合成酶、谷氨酰胺tRNA合成酶、谷氨酸tRNA合成酶、甘氨酸tRNA合成酶、组氨 酰tRNA合成酶、异亮氨酰tRNA合成酶、亮氨酰tRNA合成酶、赖氨酸tRNA合成酶、甲硫氨酰 tRNA合成酶、苯丙氨酸tRNA合成酶、脯氨酰tRNA合成酶、丝氨酰tRNA合成酶、苏氨酰tRNA 合成酶、酪氨酰tRNA合成酶或缬氨酰tRNA合成酶。6.权利要求4或5所述的突变宿主细胞，其中带有突变的宿主细胞为细菌、酵母、动物 细胞或植物细胞。7.权利要求4或5所述的突变宿主细胞，其中带有突变的宿主细胞为细菌或酵母。8.权利要求6或7...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦田勇二，大田优佳莉，日高祐子，中村信之，
申请(专利权)人：独立行政法人海洋研究开发机构，
类型：发明
国别省市：JP[日本]