基因修饰的间充质干细胞及其用于生产BsAb抗体的方法技术

本发明专利技术提供了一种基因修饰的间充质干细胞及其用于生产双特异性单链抗体(BsAb抗体)的方法，所述的基因修饰的间充质干细胞是利用携带双特异性单链抗体基因的非病毒载体转染间充质干细胞而得到的。本发明专利技术还特别提供了通过基因修饰间充质干细胞生产双特异性单链抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种基因修饰的间充质干细胞及其用于生产BsAb抗体的方法，具体而言，本专利技术涉及基因修饰的间充质干细胞、其制备方法、以及通过基因修饰间充质干细胞生产双特异性单链抗体的方法。
技术介绍
人体的免疫系统中，细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTLymphocyte，CTL)和杀伤性T细胞(Cytokineinducedkiller)扮演着重要的角色，它们拥有T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)，能够对表达目标抗原的细胞进行特异识别与结合，并分泌穿孔素和颗粒酶，从而杀灭病原靶细胞。但是，癌细胞等病变区域常表现为抗原表达缺陷、缺少免疫粘附分子和共刺激分子等物质，使得机体免疫识别功能“丧失”。近年来，依照基因重组方法构建的双靶向抗体(Bispecificantibody,BsAb)，能够同时与T细胞和癌细胞特异性抗原结合，并激活T细胞免疫机制，实现“双靶向抗体介导T细胞重新定向的抗癌效应作用”(AnticancereffectorsofBsAb-RetargetingTcell)。这种BsAb抗体协助功能性T细胞重新定位病变靶点，恢复了自体免疫功能。目前临床治疗中，所使用的BsAb抗体主要通过体外基因工程生产，经蛋白纯化后由人体静脉注射，最终只能依靠血液循环将BsAb抗体递送到靶区域。这种方法获取的BsAb抗体极易在温度变化下失活、并且该治疗方法费用昂贵；同时，BsAb抗体半衰期较短，因此降低了与靶细胞的接触概率，以至于无法形成理想的治疗效果。另一方面，应用干细胞产生细胞因子和蛋白已有相关报道。目前，对干细胞的基因修饰方法中大部分都选用病毒载体，如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒。病毒载体转染虽然能提高干细胞基因修饰的效率，但由于病毒的安全性问题，使得这种方法存在一定的局限性，如对操作环境的要求严格，如感染后病毒基因可能随机整合到细胞基因组，从而破坏细胞基因组，造成致癌风险，况且病毒载体应用于动物体内其转染效率是不高的，因为机体本身会启动沉默病毒功能的机制。此外，现有的应用干细胞进行基因转染产生细胞因子和蛋白的研究方法所产生的蛋白和功能因子分子量相对较低，并且多见于应用核糖核酸类(RNA)如mRNA作为基因载体。目前尚未见到应用干细胞生产分子量较大的双特异性单链抗体的类似报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是应用间充质干细胞创建生物活性载体，提供一种基因修饰的间充质干细胞及其制备方法与用于生产BsAb抗体的方法，从而进一步可利用间充质干细胞的生物学特性迁移至治疗区域，通过细胞自身分泌BsAb抗体进而提高免疫治疗效果。间充质干细胞(MesenchymalStemCell，MSC)来源于间质组织，具备多向分化、免疫调节和自我复制更新功能。并且，在外界因素作用下，表现出趋向损伤和癌变病变组织的定向迁移能力(归巢性能)。本专利技术通过对间充质干细胞进行基因修饰，将干细胞构建成BsAb抗体的“生产工厂”和靶向性递送系统，借助干细胞实现将抗体递送至病变区域，完成针对如癌症等疾病的干细胞介导的细胞免疫治疗(Stem-cellDrivenCancer-targetedImmunotherapy)。一方面，本专利技术提供了一种基因修饰的间充质干细胞，其是利用携带BsAb抗体基因的非病毒载体转染间充质干细胞而得到的。该基因修饰的间充质干细胞能够有效分泌双特异性单链抗体。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述间充质干细胞可以来源于脂肪、脐带、胎盘、骨髓、子宫内膜或牙髓等。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，是利用非病毒类基因载体承载BsAb抗体基因，这些非病毒载体可以选自质粒DNA(PlasmidDNA，下文缩写为DNA)或微环质粒DNA(MinicirclePlasmidDNA,下文缩写为MCDNA)等。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述BsAb抗体可以选自antiCD19×antiCD3、antiCD20×antiCD3、antiEGFR×antiCD3、antiGPC3×antiCD3、antiEpCAM×antiCD3、anticMet×antiCD3、antiEGFRvIII×antiCD3、antiIGF1R×antiCD3、antiCD44v6×antiCD3或antiPDL-1×antiCD3等。不限于以上所述的序列模式，同样适用于antiCD3×anti“靶点”的序列模式。另一方面，本专利技术还提供了所述的基因修饰的间充质干细胞的制备方法，该方法包括：将携带BsAb抗体基因的非病毒载体转染至间充质干细胞，完成对间充质干细胞的基因修饰，得到基因修饰的间充质干细胞。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，是利用化学转染试剂的化学转染方法、或电穿孔转染方法实现针对干细胞的基因修饰。具体而言，所述化学转染试剂可以包括：脂质体转染试剂(如Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染试剂)，聚阳离子转染试剂(如聚乙烯亚胺、聚氨基酯、壳聚糖等)，或是无机纳米颗粒转染试剂、有机纳米颗粒转染试剂、或无机有机杂化纳米颗粒转染试剂(如磁性纳米颗粒、磷酸盐纳米颗粒等)。所述电穿孔转染方法可以为常规电转仪操作方法。另一方面，本专利技术还提供了所述的基因修饰的间充质干细胞用于生产BsAb抗体中的应用。另一方面，本专利技术还提供了一种生产BsAb抗体的方法，该方法包括：培养本专利技术所述的基因修饰的间充质干细胞以分泌表达双特异性单链抗体。具体地，所述培养条件为37℃、5％CO2静置培养。其中优选的培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。采用本专利技术的方法，通常在培养72-96小时或更长的时间内可持续表达双特异性单链抗体，在一定程度上实现了BsAb的持续供给。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的生产BsAb抗体的方法还包括将携带BsAb抗体基因的非病毒载体转染至间充质干细胞完成对间充质干细胞的基因修饰的过程。如前所述，可以是利用化学转染试剂的化学转染方法、或电穿孔转染方法实现针对干细胞的基因修饰。所述化学转染试剂可以包括：脂质体转染试剂(如Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染试剂)，聚阳离子转染试剂(如聚乙烯亚胺、聚氨基酯、壳聚糖等)，或是无机纳米颗粒转染试剂、有机纳米颗粒转染试剂、或无机有机杂化纳米颗粒转染试剂(如磁性纳米颗粒、磷酸盐纳米颗粒等)。所述电穿孔转染方法可以为常规电转仪操作方法。根据本专利技术的更具体实施方案，本专利技术的生产BsAb抗体的方法可以按照下述方法中的任意一种进行：方法一：将具有抗体表达基因的质粒DNA或微环MCDNA4μg加入至适量的opti-MEM培养基中，终体积为100μl，静置5min；同时Lipofectamine2000基因转染试剂(Invitrogen公司)10μl加入至适量的opti-MEM培养基中，终体积为100μl，静置5min后，用移液器将质粒溶液和转染试剂溶液轻柔上下吹吸混合，室温放置30min，制成Lipofectamine2000基因载体复合物。将间充质干细胞以每孔5×105个/ml的密度接种于6孔板中(每孔5×105个细胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基常规培养，细胞融合至70％，更本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因修饰的间充质干细胞，其是利用携带BsAb抗体基因的非病毒载体转染间充质干细胞而得到的。

【技术特征摘要】
1.一种基因修饰的间充质干细胞，其是利用携带BsAb抗体基因的非病毒载体转染间充质干细胞而得到的。2.根据权利要求1所述的基因修饰的间充质干细胞，其中，所述间充质干细胞来源于滑膜、骨骼、肌肉、肺脏、肝脏、胰腺、脂肪、脐带、脐带血、胎盘、骨髓、子宫内膜或牙髓；以及包括以iPS技术诱导成体细胞转化为的间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的基因修饰的间充质干细胞，其中，所述携带BsAb抗体基因的非病毒载体选自：质粒DNA、微环质粒DNA或核糖核酸载体。4.根据权利要求1所述的基因修饰的间充质干细胞，其中，所述BsAb抗体选自antiCD19×antiCD3、antiCD20×antiCD3、antiEGFR×antiCD3、antiGPC3×antiCD3、antiEpCAM×antiCD3、anticMet×antiCD3、antiEGFRvIII×antiCD3、antiIGF1R×antiCD3、antiCD44v6×antiCD...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志勇，陈志英，谭燕，杨磊，何成宜，钟育健，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44