提供一种体外诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的方法，包括神经干细胞分离、培养和鉴定后，在含１％Ｂ２７（ｖ／ｖ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ的Ｆ１２－ＤＭＥＭ（１∶１）培养基中加入ｂＦＧＦ、肝素、层粘连蛋白后，于３７℃、５０ｍＬ／Ｌ ＣＯ↓［２］饱和湿度下诱导分化神经干细胞并体外培养７天，然后作胆碱能神经元的免疫鉴定。本发明专利技术的方法操作简单，重复性好，分化率达３０％以上。是一种获得胆碱能神经元的新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及神经干细胞的分化研究，特别是体外抑制AF116909基因诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的方法。
技术介绍
神经干细胞的发现是近年来神经科学领域研究的重大突破，已成为近期研究的热点，不仅因为其具有研究神经系统发育的重要性，更主要的是其潜在的治疗价值。Mckay等认为，神经干细胞指具有自我更新能力和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力的细胞。它的分化、迁移、成熟的过程是内因和外因相互作用的结果，内因也就是细胞基因的表达状态。神经干细胞要进入临床应用，首先要解决的是定向分化问题，因为只有搞清神经干细胞的分化机制，才能充分利用它的可塑性，以实现细胞替代。胆碱能神经元是一种重要的神经元，能取代由于肌委缩或脊髓损伤导致的运动神经元的损失，能改善人或动物的学习、记忆等能力，对老年痴呆、癫痫等也具有重要的调节作用。该专利技术为体外获得胆碱能神经元提供了一条途径，为治疗老年痴呆、癫痫等疾病提供了一定的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过采用基因调控的方法来实现神经干细胞向胆碱能神经元的定向分化。为达到上述目的，本专利技术采用的构思为将编码对应AF116909基因特异序列的并能形成小的发夹结构RNA(small hairpin RNA，shRNA)的一对57bp DNA回文序列插入到含有RNA聚和酶III(Pol III)U6启动子的pSilenCircle载体中构建成shRNA表达载体，再将该shRNA表达载体转染到NSCs中，观察到NSC的分化情况。根据上述的构思，本专利技术采用如下技术方案一种体外抑制AF116909基因诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的方法，包括以下步骤(1)神经干细胞的分离、培养和鉴定； (2)shRNA表达载体的构建按照SilenCircleTMRNAi Transcription Kit方法设计转录shRNA的对应于AF116909基因的回文序列，将两条回文序列在95℃退火合成双链序列，再与线状的pSilenCircle载体连接，转化到感受态的DH5α进行扩增，质粒抽提，测序鉴定；(3)NSC的转染转染当天，将NSCs传代，将NSCs传代，吹打制成密度为106-108个/mL的细胞悬液，取5mL该悬液置于60-mm的培养瓶中；将经测序确定为shRNA的表达载体6.0μg-10.0μg稀释在500μL无抗生素、无血清的DMEM中；同时将20μL的LipofectamineTM2000转染试剂稀释在同样体积的上述DMEM中，室温下培养5分钟后；然后将稀释的shRNA表达载体同稀释的转染试剂混合，室温培养20分钟后，最后再将此混合物转染到NSCs中；(4)胆碱能神经元的鉴定。上述的神经干细胞是从胎鼠纹状体分离得到。上述的神经干细胞的培养方法是将胎鼠纹状体在含有1％B27、20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培养基中，吹打制成细胞悬液，于37℃、50mL/L CO2饱和湿度下进行培养。上述的神经干细胞的鉴定采用免疫荧光法。上述的NSC的转染的时间为11天。上述的胆碱能神经元的鉴定采用RT-PCR定性分析法采用本专利技术的体外抑制AF116909基因诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的方法，从培养起第3天的(12±1.5)％胆碱能神经元分化率增加到第11天的(80±3.1)％。RT-PCR分析结果表明，AF116909基因mRNA的表达量同对照组相比明显减少。这说明该方法对AF116909目的基因确实得到有效的抑制，同时显示抑制该基因具有促使神经干细胞向胆碱能神经元分化的功能。具体实施例方式实验动物SD孕鼠(14d)购自上海第二军医大学动物房。神经干细胞的分离培养无菌条件下取出胎鼠的纹状体，放入含有1％B27，20ng/mL EGF，10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培养基中，吹打制成细胞悬液，于37℃，5％CO2饱和湿度下常规培养，每培养一周传代一次。神经干细胞的鉴定将细胞贴附在载玻片上生长，2天后取出。吸出培养液，用PBS洗去残余培养液，4％(m/m)多聚甲醛固定20min。PBS洗2次(每隔10分钟1次)；10％正常山羊血清封闭1h；PBS洗3次；抗nestin抗体(v/v 1∶100，用antibodybuffer稀释)4℃过夜，PBS洗3次；二抗(v/v 1∶50，用antibody buffer稀释)32℃孵育1h，PBS洗3次；50％(v/v)甘油封片，观察荧光。神经干细胞分离培养及鉴定Nestin蛋白是神经干细胞的标记蛋白，它是一种中间丝蛋白，分布在细胞质中，用抗nestin免疫荧光染色检测观察到有绿色荧光，自动聚集成团是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。这就进一步证明自胎鼠纹状体中分离培养神经干细胞方法的可靠性。shRNA表达载体的构建按照SilenCircleTMRNAi Transcription Kit方法设计转录shRNA的对应于AF116909基因的回文序列(各为57bp)，其序列为sense5’ACACCGACCCTCATTCCAGAGAGGGTTTGCTTGAAACCCTCTCTGGAATGAGGGTCT3’antisense5’AAAAAGACCCTCATTCCAGAGAGGGTTTCAAGCAAACCCTCTCTGGAATGAGGGTCG3’将两条回文序列95℃退火合成双链序列，再与线状的pSilenCircle载体连接，转化到感受态的DH5α进行扩增，质粒抽提，测序鉴定，经连接后的序列为5’ACACCGACCCTCATTCCAGAGAGGGTTTGCTTGAAACCCTCTCTGGAATGAGGGTCT3’3’GCTGGGAGTAAGGTCTCTCCCAAACGAACTTTGGGAGAGACCTTACTCCCAGAAAAA5’NSC的转染转染当天，将NSCs传代，吹打制成密度为4×106个/mL的细胞悬液，取5mL该悬液置于60-mm的培养瓶中，将将经测序确定为shRNA的表达载体8.0μg稀释在500μL无抗生素、无血清的DMEM中，将20μL的LipofectamineTM2000转染试剂稀释在同样体积的上述DMEM中，室温下培养5分钟后，再将稀释的shRNA表达载体同稀释的转染试剂混合，室温培养20分钟后，最后再将此混合物转染到NSCs中，同时设计对照，细胞在于37℃，50mL/L CO2饱和湿度下常规培养，观察实验组与对照组细胞的分化情况，并作相关的实验记录。胆碱能神经元的鉴定培养11天后，分别收集实验组与对照组细胞，用Trizol分别抽提总RNA，纯化，各取2μg RNA为模板进行cDNA合成(其合成方法按照AMV FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行)。再以合成的cDNA为模板进行PCR分别对实验组与对照组中AF116909基因mRNA表达量的定性分析。其PCR引物为5’CTGTGGACTCCTGGTCAG3’(Forward)和5’GTCTGTCCAGATGCTTCT3’(Reverse)，PCR产物大小为380bp。NSCs转染后细胞形态观察未转染shRNA表达载体的对照组和转染有shRNA表达载体的实验组分别培养并计算培本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种体外抑制ＡＦ１１６９０９基因诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的方法，包括以下步骤：（１）神经干细胞的分离、培养和鉴定；（２）ｓｈＲＮＡ表达载体的构建：按照ＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ↑［ＴＭ］ＲＮＡｉＴｒａｎｓｃｒｉｐ ｔｉｏｎＫｉｔ方法设计转录ｓｈＲＮＡ的对应于ＡＦ１１６９０９基因的回文序列，将两条回文序列在９５℃退火合成双链序列，再与线状的ｐＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ载体连接，转化到感受态的ＤＨ５α进行扩增，质粒抽提，测序鉴定；（３）ＮＳＣ的转 染：转染当天，将ＮＳＣｓ传代，吹打制成密度为１０↑［６］－１０↑［８］个／ｍＬ的细胞悬液，取５ｍＬ该悬液置于６０－ｍｍ的培养瓶中；将经测序确定为ｓｈＲＮＡ的表达载体６．０μｇ－１０．０μｇ稀释在５００μＬ无抗生素、无血清的ＤＭＥＭ中；同时将２０μＬ的Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ↑［ＴＭ］２０００转染试剂稀释在同样体积的上述ＤＭＥＭ中，室温下培养５分钟后；然后将稀释的ｓｈＲＮＡ表达载体同稀释的转染试剂混合，室温培养２０分钟后，最后再将此混合物转染到ＮＳＣｓ中；（４）胆碱能 神经元的鉴定。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：任雯雯，杨洋，陈付学，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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