一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，首先利用聚醚酰亚胺将二氧化钛纳米颗粒表面的羧基官能团氨基化，然后将氨基甲酸叔丁酯‑聚乙二醇（分子量为3000）‑N‑羟基琥珀酰亚胺偶联到氨基化的二氧化钛纳米颗粒上，脱Boc基团后与蛋白交联剂SMCC或Sulfo‑SMCC反应，然后再连巯基化的Ep‑CAM抗体，从而将Ep‑CAM抗体修饰到二氧化钛纳米颗粒上。本发明专利技术制备的具有良好生物兼容性的可降解二氧化钛纳米复合材料，实现了循环肿瘤细胞（CTCs）的无损俘获。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医用纳米材料领域，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法。
技术介绍
在过去的几十年间，高速的生活节奏、不健康的生活方式和食品安全问题的凸显、以及污染加剧导致的人类生存环境恶化等因素使得恶性肿瘤（即癌症）的发病率和死亡率不断提高。在我国，癌症死亡率为全部疾病死亡率之首。癌症已经严重威胁着国人的生命健康，给患者家人和亲友带来沉重的经济负担和巨大的精神痛苦，也成为影响社会稳定的不良因素。实际上，90%的癌症致死病例中导致患者死亡的主要原因都是由于相关癌症在人体内发生转移而引起了多个器官的功能性衰竭。因此，对于癌症转移机制的研究在帮助人们开发抑制癌症转移的药物和治疗措施，提高患者生存率，乃至最终完全战胜癌症方面都有着极为重要的意义。随着研究的不断深入，人们逐渐找到了癌症转移的关键承载体，即所谓的循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCells,CTCs）。循环肿瘤细胞通常是指来自于原发的肿瘤病灶，经过从组织脱落、移动和侵染等过程而进入人体外周血中的癌细胞。这些细胞中的一部分会在合适的组织附近侵出血管附着到组织上，在条件适宜时开始增殖，最终形成新的恶性肿瘤，完成癌症的转移过程。在外周血中检测到肿瘤细胞就预示着有发生癌症侵袭转移的可能，表明外周血CTCs检测技术有发展成为具有高度可行性和可重复性的非侵入性的新型诊断手段的可能，其标本更易获得、创伤性小，可随时根据需要多次采集，具有实时监测功能。而针对CTCs进行的细胞生物学和分子生物学分析则可以从生理机制方面全面了解CTCs在癌症侵袭转移和复发中所起到的关键作用，帮助我们在理解癌症转移与复发原因的基础上开发抑制癌症转移的药物和治疗措施，辅助肿瘤科医生给出更明确的患者诊断和治疗手段。基于CTCs的相关研究在监测癌症复发与转移、快速评估药效、个性化治疗方案乃至最终完全战胜癌症等方面都将发挥重要作用，显示出广阔的应用前景。虽然在技术上，当前对于CTCs的捕获与富集已经相对比较成熟，手段也逐渐丰富和完善，但是不能得到足够的可自由处理的样本就无法进行相关的分析工作，因而如何制备能有效无损俘获CTCs的纳米材料仍然是当前CTCs研究的难点所在。
技术实现思路
本专利技术将二氧化钛纳米功能材料和Ep-CAM抗体修饰技术相结合，提供了一种能够高效无损俘获CTCs的纳米材料制备方法。具体技术方案如下：一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，包括以下步骤：（一）取表面羧基化的二氧化钛纳米颗粒溶液，加入碳酸盐缓冲液，超声振动分散二氧化钛纳米颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入聚醚酰亚胺(PEI)的碳酸盐缓冲液，反应一段时间，用碳酸盐缓冲液清洗二氧化钛纳米颗粒，本步骤利用聚醚酰亚胺(PEI)将二氧化钛纳米颗粒表面的羧基官能团氨基化；（二）将步骤（一）得到的表面氨基化的二氧化钛纳米颗粒，加入氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（t-Boc-NH-PEG-3000-NHS）碳酸盐缓冲液中，充分反应后用超纯水清洗，得到表面聚乙二醇化的二氧化钛纳米颗粒；（三）将步骤（二）得到的表面聚乙二醇化的二氧化钛纳米颗粒加入到适量的三氟乙酸中，超声振荡，反应一段时间后，用磷酸盐（PBS）缓冲液清洗脱Boc后的二氧化钛纳米颗粒；（四）将步骤（三）得到的脱Boc后的二氧化钛纳米颗粒，加入蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）或者4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）的二甲基甲酰胺溶液中进行反应，得到修饰有蛋白交联剂的二氧化钛纳米颗粒；（五）在Ep-CAM抗体溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）或者N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP），反应一段时间；（六）将得到的Ep-CAM抗体溶液，加入脱乙酰缓冲液，反应后，用脱盐柱脱去Ep-CAM抗体溶液中的盐；（七）将步骤（四）得到的修饰有蛋白交联剂的二氧化钛纳米颗粒，加入Ep-CAM抗体溶液，反应一段时间，用磷酸盐缓冲液清洗，得到二氧化钛纳米颗粒复合物，在4℃保存备用。优选的，所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，步骤（一）中所用羧基化的二氧化钛纳米颗粒为实心二氧化钛纳米颗粒、二氧化钛纳米棒，二氧化钛纳米笼，二氧化钛纳米壳球体，粒径为1-100nm，浓度为0.01-2nmol/L。优选的，所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，步骤（一）和步骤（二）中所用碳酸盐缓冲液为pH条件为8.2的0.05moI/L碳酸钠水溶液，步骤（一）中所用聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液浓度为2%-20%，反应时间为1-4h。优选的，所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，步骤（二）中所用的t-Boc-NH-PEG-3000-NHS碳酸盐缓冲液中PEG浓度为l-40mmol/L，反应时间为1-3h。优选的，所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，步骤（三）中与三氟乙酸反应时间为5-10min。优选的，所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，步骤（四）中所用的蛋白交联剂SMCC先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，或者Sulfo-SMCC首先溶解于超纯水中，然后再将SMCC或者Sulfo-SMCC溶液加入到PBS缓冲液中，浓度为0.2-4mg/mL，反应时间为10-40min。优选的，所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，步骤（五）中所用的蛋白修饰试剂SATA或SATP先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，然后再加入到Ep-CAM抗体溶液中，其与Ep-CAM抗体的摩尔比率范围为10:1到250:1，反应时间为0.5-3h。优选的，所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，步骤（六）中所用的脱乙酰缓冲液为0.5mol/L羟胺，25mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），PBS缓冲体系，pH7.2-7.5，反应时间为1-3h。优选的，所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法步骤（七）中所用的Ep-CAM抗体溶液浓度为1-20ug/mL，反应时间为1-2h。本专利技术提供的用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，与现有技术相比具有以下有益效果：1.本专利技术采用具有良好生物兼容性的可降解二氧化钛纳米材料，无毒无害，非磁性的二氧化钛纳米粒子分散性好、不易聚集；2.本专利技术通过将Ep-CAM抗体修饰到二氧化钛纳米颗粒上，实现了对循环肿瘤细胞的特异性识别和无损俘获，对样本的分析速度更快，准确度更高，在癌症转移的预警和预防领域有良好的应用前景；3.本专利技术的制备方法操作简单，反应条件温和，利于工业化生产。附图说明图1为一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备步骤；图2为二氧化钛纳米颗粒的扫描电子显微镜照片；图3为实施例1所得到的纳米材料对术后结肠癌病人血样中微量的循环肿瘤细胞俘获的荧光图；图4为根据本专利技术所得到的纳米材料从10名癌症病人血样中俘获的循环肿瘤细胞的数目。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下结合本专利技术的优选实施例，并配合附图进行详细描述。实施例1一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，包括以下步骤（图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（一）取表面羧基化的二氧化钛纳米颗粒溶液，加入碳酸盐缓冲液，超声振动分散表面羧基化的二氧化钛纳米颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入聚醚酰亚胺（PEI）的碳酸盐缓冲液，反应一段时间，用碳酸盐缓冲液清洗反应后的二氧化钛纳米颗粒，本步骤利用聚醚酰亚胺（PEI）将二氧化钛纳米颗粒表面的羧基官能团氨基化；（二）将步骤（一）得到的表面氨基化的二氧化钛纳米颗粒，加入氨基甲酸叔丁酯‑聚乙二醇（分子量为3000）‑N‑羟基琥珀酰亚胺（t‑Boc‑NH‑PEG‑3000‑NHS）碳酸盐缓冲液中，充分反应后用超纯水清洗，得到表面聚乙二醇化的二氧化钛纳米颗粒；（三）将步骤（二）得到的表面聚乙二醇化的二氧化钛纳米颗粒加入到适量的三氟乙酸中，超声振荡，反应一段时间后，用磷酸盐（PBS）缓冲液清洗脱Boc后的二氧化钛纳米颗粒；（四）将步骤（三）得到的脱Boc后的二氧化钛纳米颗粒，加入蛋白交联剂4‑（N‑马来酰亚胺基甲基）环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）或者4‑（N‑马来酰亚胺甲基）环己烷‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo‑SMCC）的二甲基甲酰胺溶液中进行反应，得到修饰有蛋白交联剂的二氧化钛纳米颗粒；（五）在Ep‑CAM抗体溶液中加入蛋白修饰试剂N‑琥珀酰亚胺‑S‑乙酰基硫代乙酸酯（SATA）或者N‑琥珀酰亚胺‑3‑乙酰硫代丙酸酯（SATP），反应一段时间；（六）将步骤（五）反应得到的Ep‑CAM抗体溶液，加入脱乙酰缓冲液，反应后，用脱盐柱脱去Ep‑CAM溶液中的盐；（七）将步骤（四）得到的修饰有蛋白交联剂的二氧化钛纳米颗粒，加入Ep‑CAM抗体溶液，反应一段时间，用磷酸盐缓冲液清洗，得到二氧化钛纳米颗粒复合物，在4 ℃保存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（一）取表面羧基化的二氧化钛纳米颗粒溶液，加入碳酸盐缓冲液，超声振动分散表面羧基化的二氧化钛纳米颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入聚醚酰亚胺（PEI）的碳酸盐缓冲液，反应一段时间，用碳酸盐缓冲液清洗反应后的二氧化钛纳米颗粒，本步骤利用聚醚酰亚胺（PEI）将二氧化钛纳米颗粒表面的羧基官能团氨基化；（二）将步骤（一）得到的表面氨基化的二氧化钛纳米颗粒，加入氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（t-Boc-NH-PEG-3000-NHS）碳酸盐缓冲液中，充分反应后用超纯水清洗，得到表面聚乙二醇化的二氧化钛纳米颗粒；（三）将步骤（二）得到的表面聚乙二醇化的二氧化钛纳米颗粒加入到适量的三氟乙酸中，超声振荡，反应一段时间后，用磷酸盐（PBS）缓冲液清洗脱Boc后的二氧化钛纳米颗粒；（四）将步骤（三）得到的脱Boc后的二氧化钛纳米颗粒，加入蛋白交联剂4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）或者4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）的二甲基甲酰胺溶液中进行反应，得到修饰有蛋白交联剂的二氧化钛纳米颗粒；（五）在Ep-CAM抗体溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）或者N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP），反应一段时间；（六）将步骤（五）反应得到的Ep-CAM抗体溶液，加入脱乙酰缓冲液，反应后，用脱盐柱脱去Ep-CAM溶液中的盐；（七）将步骤（四）得到的修饰有蛋白交联剂的二氧化钛纳米颗粒，加入Ep-CAM抗体溶液，反应一段时间，用磷酸盐缓冲液清洗，得到二氧化钛纳米颗粒复合物，在4℃保存备用。2.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（一）中所用羧基化的二氧化钛纳米颗粒为实心二氧化钛纳米颗粒、二氧化钛纳米棒，二氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：周世媛，王凤羽，朱爱荣，王海丽，窦永恒，石向东，杜袆铭，王润波，薛芬，
申请(专利权)人：河南省人口和计划生育科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41