基于多功能化二硫化钼的miRNA-21电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了基于多功能化二硫化钼的miRNA‑21电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用，特点是包括将制备的Fe3O4磁性纳米颗粒进行氨基化，然后与氯金酸反应制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的步骤；将制备的单片层MoS2进行羧基化，后依次与偶联试剂、信号DNA溶液和鲁米诺溶液反应，最后加入巯基己醇溶液震荡清洗得到信号单元溶液的步骤；将Fe3O4@Au与捕获DNA溶液反应得到捕获单元溶液的步骤；最后将捕获单元溶液滴涂于磁性玻碳电极表面，然后依次将miRNA‑21、信号单元溶液滴涂于磁性玻碳电极表面即可，优点是灵敏度高，特异性强、准确性高以及操作步骤简单，实验成本低。

Preparation method of multifunctional miRNA MoS2 21 electrochemiluminescence immunosensor and its application based on

The invention discloses a preparation method and application of multi function miRNA MoS2 21 electrochemiluminescence immunosensor based on features including Fe3O4 magnetic nanoparticles prepared by amination and preparation of Fe3O4@Au magnetic nanoparticles and HAuCl4 reaction steps were carboxylated; will MoS2 the preparation of monolithic layer after, in turn with the coupling reagent, signal DNA solution and Lumino solution reaction, finally adding 6-mercapto-1-hexanol solution shock cleaning solution step signal unit; Fe3O4@Au and DNA will capture the solution reaction capture unit solution steps; finally the capture unit solution onto the surface of magnetic glassy carbon electrode, then miRNA 21, signal unit solution drop onto the magnetic glassy carbon electrode surface, has the advantages of high sensitivity, strong specificity, high accuracy and simple operation steps, Low experimental cost.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种电化学发光免疫传感器及其检测方法，尤其是涉及一种基于多功能化二硫化钼材料的miRNA-21电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用，属于功能材料和生物传感

技术介绍
癌症，也称恶性肿瘤，本质上是一种多基因疾病，是由细胞生长增殖机制失常引起的疾病，严重危害人类的健康。据WHO报告与预测，全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。肿瘤专家认为，实现对肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗，可以有效地预防癌症，其中早期诊断是关键。肿瘤标志物的发现使得早期诊断成为可能。肿瘤标志物是在肿瘤的发生和增殖过程中产生、反映肿瘤存在和生长的一类物质，因此，检测肿瘤标志物对癌症患者有极其重要的意义。研究发现，人体的很多肿瘤中都存在miRNA的差异表达，在这些差异表达中miRNA-21较为特殊，高表达的miRNA-21发挥着原癌基因的作用，一旦被激活，就会诱导或促进肿瘤的发生发展，因此，miRNA-21可作为有效的肿瘤标志物。目前miRNA-21的检测方法主要有Northern印迹分析、微阵列芯片法、实时荧光定量PCR法和原位杂交法等。Northern印记分析操作繁琐、耗时长、灵敏度低，检测时需要大量样品，并且对RNase污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响实验结果；实时荧光定量PCR的低选择性和非线性目标的放大可能会导致基因表达的失真，只能用来量化miRNA前体的表达，而不能量化成熟的miRNA表达；微阵列芯片制作和检测费用很高，芯片上可利用体积很小，导致灵敏度不高。因此，建立一种灵敏、准确、快速、简便的miRNA-21检测方法是迫切需求。电化学发光免疫分析方法是电化学发光和免疫分析相结合的产物，它具有灵敏度高、响应快速、选择性强、重现性好、易于操作、步骤简单等优点，具有良好的应用前景。二硫化钼（MoS2）是一类与石墨烯有着类似结构的层状无机化合物，具有较大的比表面积、良好的导电性以及较好的化学稳定性，其在电化学发光免疫传感器方面受到关注。目前，国内外还没有关于基于多功能化二硫化钼的miRNA-21电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高，特异性强、准确性高以及操作步骤简单，实验成本低的基于多功能化二硫化钼的miRNA-21电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于多功能化二硫化钼的miRNA-21电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的制备a.制备Fe3O4磁性纳米颗粒：将0.7～1.0gFeCl3·6H2O和0.2～0.5gFeCl2·4H2O溶于50～100mL的二次水后加入到三口烧瓶中，通氮气，磁力搅拌混合均匀，温度升高到80～100℃，向三口烧瓶中缓慢滴加20～25wt%的氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2h后，停止加热，在氮气的保护下，搅拌回流，冷却至室温，制备得到的黑色沉淀物即为Fe3O4磁性纳米颗粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50mL；b.制备氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒：将步骤a所制备的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1h，加入0.2～0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），搅拌4～5h，加入1～2mL0.1～0.5mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4h后，得到氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100mL；c.制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒：将5～10mL步骤b所制备的氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20mL1wt%HAuCl4在60～100kHz的超声频率下混合，搅拌1h后，缓慢加入30～50mL20～30mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3h，得到Fe3O4@Au磁性纳米颗粒，二次水清洗，定容至20mL；（2）信号单元（(signalDNA&luminol)@MoS2）的合成a.制备单片层MoS2：称取0.8～1gMoS2粉末加入高压釜，随后加入30～35mL0.4～0.5mol/L的正丁基锂正己烷溶液，将高压釜密封后放在100℃真空干燥箱中反应4～5h，获得的产物过滤洗涤，在60℃真空烘箱中干燥得到锂离子插层的二硫化钼；取0.1～0.2g锂离子插层的二硫化钼分散在200～300mL水中，室温下超声4～5h，得到单分子层的MoS2水溶液，冷冻干燥后得到MoS2粉末；b.制备羧基化MoS2：将0.04～0.05g步骤a所制备的MoS2粉末加入到40～50mL30～40mmol/L的半胱氨酸溶液中，在超声仪中超声2～3h，低速离心除去未完全剥离的MoS2，最终获得羧基化的MoS2纳米片层；c.合成信号单元（(signalDNA&luminol)@MoS2）：取100～200μL1～2mg/mL羧基化的MoS2纳米片层溶液超声1h，加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，用0.5～1.0mol/L盐酸调节溶液pH为4～6，常温震荡30～40min，离心洗涤去除上清液以去除多余的偶联试剂，取沉淀定容至200～300μL；加入20～30μL1～5μmol/L信号DNA（signalDNA）溶液和20～30μL0.05～0.1mol/L鲁米诺（luminol）溶液，用1～2mol/L氢氧化钠调节溶液pH为9～10，混合均匀，常温震荡3～4h；最后加入10～20µL10～20mmol/L巯基己醇（MCH）溶液封闭非特异性吸附位点，继续震荡1～2h，用二次水清洗离心去除上清液以去除剩余的MCH、未结合的signalDNA和luminol，最后将沉淀分散在杂交缓冲液中定容至30～50μL，即得到信号单元（(signalDNA&luminol)@MoS2）溶液；（3）捕获单元（Fe3O4@Au-captureDNA）的合成取50～100µLFe3O4@Au溶液超声5～10min，加入20～50µL1～5μmol/L捕获DNA（captureDNA）溶液，用DNA固定缓冲液定容至200µL，混合均匀，37℃下震荡3～4h，暗处放置24h，利用Au-S键合作用，captureDNA自组装在Fe3O4@Au的表面，清洗去掉未结合的captureDNA；滴加10～20µL10～20mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，用水清洗离心去上清以去除多余的MCH，取沉淀用水定容至100µL，即得到捕获单元（Fe3O4@Au-captureDNA）溶液，4℃下保存备用；（4）电化学发光免疫传感器组装a.将直径为3～5mm磁性玻碳电极依次用0.1、0.3、0.05µmol/LAl2O3浆抛光成镜面，依次用无水乙醇、蒸馏水超声波清洗，N2吹干；b.取5～10µL捕获单元（Fe3O4@Au-captureDNA）溶液滴涂于上述预处理过的磁性玻碳电极表面，通过磁性作用，捕获单元即被牢固地吸附在电极表面，然后将5～10µLmiRNA-21溶液滴涂在电化学发光免疫传感器上，置于37℃中孵育1～2h，清洗；再取5～10µL步骤（2）所得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于多功能化二硫化钼的miRNA‑21电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的制备a. 制备Fe3O4磁性纳米颗粒：将0.7～1.0 g FeCl3·6H2O和0.2～0.5 g FeCl2·4H2O溶于50～100 mL的二次水后加入到三口烧瓶中，通氮气，磁力搅拌混合均匀，温度升高到80～100℃，向三口烧瓶中缓慢滴加20～25wt%的氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2 h后，停止加热，在氮气的保护下，搅拌回流，冷却至室温，制备得到的黑色沉淀物即为Fe3O4磁性纳米颗粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50 mL；b. 制备氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒：将步骤a所制备的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1 h，加入0.2～0.3 mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4～5 h，加入1～2 mL 0.1～0.5 mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4 h后，得到氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100 mL；c. 制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒：将5～10 mL步骤b所制备的氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20 mL 1wt%HAuCl4在60～100 kHz的超声频率下混合，搅拌1 h后，缓慢加入30～50 mL 20～30 mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3 h，得到Fe3O4@Au磁性纳米颗粒，二次水清洗，定容至20 mL；（2）信号单元的合成a. 制备单片层MoS2：称取0.8～1 g MoS2粉末加入高压釜，随后加入30～35 mL 0.4～0.5 mol/L的正丁基锂正己烷溶液，将高压釜密封后放在100℃真空干燥箱中反应4～5 h，获得的产物过滤洗涤，在60℃真空烘箱中干燥得到锂离子插层的二硫化钼；取0.1～0.2 g 锂离子插层的二硫化钼分散在200～300 mL水中，室温下超声4～5 h，得到单分子层的MoS2水溶液，冷冻干燥后得到MoS2粉末；b. 制备羧基化MoS2：将0.04～0.05 g步骤a所制备的MoS2粉末加入到40～50 mL 30～40 mmol/L的半胱氨酸溶液中，在超声仪中超声2～3 h，低速离心除去未完全剥离的MoS2，最终获得羧基化的MoS2纳米片层；c. 合成信号单元：取100～200 μL 1～2 mg/mL羧基化的MoS2纳米片层溶液超声1 h，加入200～400 μL偶联试剂，混合均匀，用0.5～1.0 mol/L盐酸调节溶液pH为4～6，常温震荡30～40 min，离心洗涤去除上清液，取沉淀定容至200～300 μL；加入20～30 μL 1～5 μmol/L信号DNA溶液和20～30 μL 0.05～0.1 mol/L鲁米诺溶液，用1～2 mol/L氢氧化钠调节溶液pH为9～10，混合均匀，常温震荡3～4 h；最后加入10～20 µL 10～20 mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，继续震荡1～2 h，用二次水清洗离心去除上清液，最后将沉淀分散在杂交缓冲液中定容至30～50 μL，即得到信号单元溶液；（3）捕获单元的合成取50～100 µL Fe3O4@Au溶液超声5～10 min，加入20～50 µL 1～5 μmol/L捕获DNA溶液，用DNA固定缓冲液定容至200 µL，混合均匀，37℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h；然后滴加10～20 µL 10～20 mmol/L 巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，用水清洗离心去上清以去除多余的MCH，取沉淀用水定容至100 µL，即得到捕获单元溶液，4 ℃下保存备用；（4）电化学发光免疫传感器组装a. 将直径为3～5 mm磁性玻碳电极依次用0.1、0.3、0.05 µmol/L Al2O3浆抛光成镜面，依次用无水乙醇、蒸馏水超声波清洗，N2吹干；b. 取5～10 µL捕获单元溶液滴涂于上述预处理过的磁性玻碳电极表面，通过磁性作用，捕获单元即被牢固地吸附在电极表面，然后将5～10 µL miRNA‑21溶液滴涂在电化学发光免疫传感器上，置于37℃中孵育1～2 h，清洗；再取5～10 µL步骤（2）所得的信号单元溶液，置于37 ℃中孵育1～2 h后，清洗得到基于多功能化二硫化钼的miRNA‑21电化学发光免疫传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种基于多功能化二硫化钼的miRNA-21电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的制备a.制备Fe3O4磁性纳米颗粒：将0.7～1.0gFeCl3·6H2O和0.2～0.5gFeCl2·4H2O溶于50～100mL的二次水后加入到三口烧瓶中，通氮气，磁力搅拌混合均匀，温度升高到80～100℃，向三口烧瓶中缓慢滴加20～25wt%的氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2h后，停止加热，在氮气的保护下，搅拌回流，冷却至室温，制备得到的黑色沉淀物即为Fe3O4磁性纳米颗粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50mL；b.制备氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒：将步骤a所制备的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1h，加入0.2～0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4～5h，加入1～2mL0.1～0.5mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4h后，得到氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100mL；c.制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒：将5～10mL步骤b所制备的氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20mL1wt%HAuCl4在60～100kHz的超声频率下混合，搅拌1h后，缓慢加入30～50mL20～30mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3h，得到Fe3O4@Au磁性纳米颗粒，二次水清洗，定容至20mL；（2）信号单元的合成a.制备单片层MoS2：称取0.8～1gMoS2粉末加入高压釜，随后加入30～35mL0.4～0.5mol/L的正丁基锂正己烷溶液，将高压釜密封后放在100℃真空干燥箱中反应4～5h，获得的产物过滤洗涤，在60℃真空烘箱中干燥得到锂离子插层的二硫化钼；取0.1～0.2g锂离子插层的二硫化钼分散在200～300mL水中，室温下超声4～5h，得到单分子层的MoS2水溶液，冷冻干燥后得到MoS2粉末；b.制备羧基化MoS2：将0.04～0.05g步骤a所制备的MoS2粉末加入到40～50mL30～40mmol/L的半胱氨酸溶液中，在超声仪中超声2～3h，低速离心除去未完全剥离的MoS2，最终获得羧基化的MoS2纳米片层；c.合成信号单元：取100～200μL1～2mg/mL羧基化的MoS2纳米片层溶液超声1h，加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，用0.5～1.0mol/L盐酸调节溶液pH为4～6，常温震荡30～40min，离心洗涤去除上清液，取沉淀定容至200～300μL；加入20～30μL1～5μmol/L信号DNA溶液和20～30μL0.05～0.1mol/L鲁米诺溶液，用1～2mol/L氢氧化钠调节溶液pH为9～10，混合均匀，常温震荡3～4h；最后加入10～20µL10～20mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，继续震荡1～2h，用二次水清洗离心去除上清液，最后将沉淀分散在杂交缓冲液中定容至30～50μL，即得到信号单元溶液；（3）捕获单元的合成取50～100µLFe3O4@Au溶液超声5～10min，加入20～50µL1～5μmol/L捕获DNA溶液，用DNA固定缓冲液定容至200µL，混合均匀，37℃下震荡3～4h，暗处放置24h；然后滴加10～20µL10～20mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，用水清洗离心去上清以去除多余的MCH，取沉淀用水定容至100µL，即得到捕获单元溶液，4℃下...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢静，郭智勇，胡宇芳，沙玉红，武琳，俞欣辰，郭富米，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33