一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种甘胆酸测定试剂及其制备方法，属于生化手段测试技术领域。包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样，所述的R1试剂是由硫代氧化型辅酶溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由还原型辅酶溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。将本发明专利技术应用于甘胆酸测定，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法，属于生化手段测试

技术介绍
血清甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，在肝细胞内，胆固醇经过极其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CD-CA)。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合，分子量为462u。CG在肝细胞合成，经胆管排入胆囊贮存，餐后胆囊收缩，随同胆汁排入小肠，参与脂肪的消化吸收，95％的胆酸由小肠粘膜重吸收入血，经门静脉输送至肝脏由肝细胞摄取。正常情况下，肝脏能有效摄取门静脉血中99％以上的CG重新泌入胆汁，仅有1％CG溢入体循环。当肝细胞受损时，肝细胞不能有效摄取经肠肝循环达肝脏的CG，致使血中CG含量增高；胆汁淤滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍而返流入血循环中，也可使血中CG含量增高。临床证明：肝损伤的生化指标中CG比谷丙转氨酶、胆红素等试验更敏感，具体如下：(1)在急性肝炎、慢性活动性肝炎、原发性肝癌、肝硬化及慢性迁延性肝炎等病症中，其血清CG的水平均高于正常对照组，升高阳性率按上述顺序递减，尤其在临床鉴别慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎方面，慢活肝CG升高的幅度和频率均高于慢迁肝，CG可作为一项有价值的指标，对判断慢性活动性肝炎的进展和缓解，预测疗效和复发均有很好价值。(2)血清甘胆酸含量升高程度与肝硬化的病理发展进程呈正相关，是临床判断肝硬化程度和预后的很好的指标。(3)血清甘胆酸水平在胆结石患者显著升高，可高达50倍。(4)梗阻性肝病时，CG水平增高10-20倍，药物性胆汁郁积症血清胆酸也增高。(5)孕妇在怀孕的中后期，由于婴儿的增大，会压迫肝脏，使肝脏排泄胆酸发生障碍而导致CG的偏高，严重者可能会导致死胎。(6)妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepaticcholestasisofpregnancy,ICP)又称妊娠迟发性胆汁淤积,属高危妊娠之一。本病虽然无孕妇死亡,但对胎儿有严重影响,易发生早产,胎儿宫内窘迫甚至围产儿死亡。目前国内测定甘胆酸的方法主要有：(1)乳胶增强免疫比浊法，该方法灵敏度较低，易出现前带现象。(2)化学发光法，该方法虽然灵敏度高，但不稳定，重复性较差。(3)酶联免疫法，该方法定量准确性差，操作时间长，自动化程度低，一般只用于定性检测。基于此，做出本申请。
技术实现思路
为了克服现有甘胆酸在测试过程中存在的上述缺陷，本专利技术首先提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、操作简便，适用于临床全自动或半自动生化分析的甘胆酸测定试剂。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种甘胆酸测定试剂，包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样，所述的R1试剂是由硫代氧化型辅酶I溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由还原型辅酶I溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。进一步的，作为优选：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷，更优选的，所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.0，浓度为0.65mol/L。所述的硫代氧化型辅酶I为β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)，其浓度为1g/L。所述的还原型辅酶I为β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型(NADH)，其浓度为6g/L。所述的甘胆酸脱氢酶浓度≥5000U/L。所述的叠氮钠浓度为0.6mol/L。同时，本专利技术还提供了一种具有上述特征甘胆酸测定试剂的制备方法，包括如下步骤：(1)R1试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解；加入硫代氧化型辅酶I搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；(2)R2试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解；加入甘胆酸脱氢酶，搅拌至溶解；添加叠氮钠搅拌至溶解，加入还原型辅酶I搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；(3)甘胆酸标准样配制：向纯化水中加入甘胆酸钠水合物，搅拌至完全溶解；加入缓冲液搅拌至溶解，加入叠氮钠搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；(4)对上述制备的R1试剂、R2试剂及甘胆酸标准样进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。进一步的，作为优选：所述的搅拌速度为450转/分。步骤(1)中，所述的纯化水为1500ml，定容体积为1600ml。步骤(2)中，所述的纯化水为300ml，定容体积为400ml。步骤(3)中，所述的纯化水为80ml，定容体积为100ml。本专利技术的工作原理如下：甘胆酸标准样中的甘胆酸被甘胆酸脱氢酶(GCDH)及β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)特异性地氧化，生成类固醇以及β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原Thio-NADH；而生成的类固醇在GCDH和β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型(NADH)作用下，又生成甘胆酸及β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(NAD)。通过上述的循环，血清中微量的胆汁酸量得到了放大，Thio-NADH也同比的扩增，于是通过测定Thio-NADH在405nm特异性的吸光度变化，即可计算得到标本中甘胆酸的含量。上述工作原理中，其反应过程具体如下：(1)灵敏度评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》中对“分析灵敏度”检测的要求，以试剂盒在规定参数下对分析灵敏度评价用样本进行检测产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度的差值(ΔA)作为分析灵敏度。分析灵敏度评价试验对分析灵敏度评价用样本重复测定20次。评估结果：分析灵敏度2.7mg/L吸光度变化率(ΔA/min)≥0.00405ABS/min。(2)线性范围评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》和《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——线性范围(征求意见稿)》中的建议，对试剂线性范围进行验证时，在待验证线性范围内选择5个浓度水平，每个浓度水平重复测定3次。(3)精密度评价试验精密度评价包括重复性和批间差，且至少评估二个浓度水平样本的精密度，其中有一个浓度在医学决定水平左右。因此，重复性评价采用在重复性条件下，用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)测试，每个浓度重复测试10次；批间差评价采用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)分别测试3个不同批号的试剂盒，每个批号测试3次。(4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样，所述的R1试剂是由硫代氧化型辅酶I溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由还原型辅酶I溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。

【技术特征摘要】
1.一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样，所述的R1
试剂是由硫代氧化型辅酶I溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂
是由还原型辅酶I溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；
所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。
2.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲
液或三羟甲基氨基甲烷。
3.如权利要求2所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的pH为
7.0，浓度为0.65mol/L。
4.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：所述的硫代氧化型辅酶I为
β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型，其浓度为1g/L。
5.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：所述的还原型辅酶I为β-烟
酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型，其浓度为6g/L。
6.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：所述的甘胆酸脱氢酶浓度≥
5000U/L。
7.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：所述的叠氮钠浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：方朝君，
申请(专利权)人：浙江达美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33