通过基因治疗自行调控炎性细胞的凋亡制造技术

本发明专利技术涉及嵌合核酸，及涉及通过将该嵌合核酸导入活化的炎性细胞或处于炎性部位的细胞中，以治疗诱导这些细胞的凋亡。该嵌合核酸具有至少一个ＴＮＦα启动子的增强子，该增强子连接至ＴＮＦα启动子的功能性拷贝上且进一步连接至凋亡－诱导基因的至少一个拷贝上，而该凋亡－诱导基因又进一步连接至３′ＵＴＲ上。该凋亡－诱导基因是粒酶Ｂ。本发明专利技术还涉及制备并使用自我调控凋亡的嵌合核酸的方法，及用于治疗炎性疾病的含有这类核酸的药物组合物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学与免疫学领域。更具体地，本专利技术涉及通过将一种诱导炎性细胞凋亡(程序性细胞死亡或非-坏死性细胞死亡)的基因导入所述细胞中，而诱导它们凋亡。
技术介绍
在很多炎性状况中，因炎性细胞的大量聚集和累积而使诸如IL-1β、IL-10、GM-CSF及TNFα等细胞因子过量产生(Brennan F．M．等人，BritishMedical Bulletin，1995，51／2，368-384)。炎性组织中细胞因子的增量调节和／或调节异常可能直接或间接造成慢性炎性疾病的恶化。例如，类风湿性关节炎(RA)的最具特征性病理出现在局部炎性部位(亦即，滑膜关节)。因此，似乎表示RA病患者的滑膜关节中所产生的细胞因子在疾病过程中起着重要作用。在这些细胞因子中，据信IL-1β及TNFα是造成破坏性软骨毁坏及成为RA特征之骨腐蚀的原因(Dayer J．M．等人，J．Exp．Med．，1985，162，1208-1215；Gowen M．等人，Nature，1983，306，378-380)。滑膜关节中过量IL-1β及TNFα的存在已显示会加速啮齿类中由胶原蛋白所诱导的关节炎的发展(Brennan F．M．等人，Clin．Expt．Immunol.，1994，97／1，1-3)。凋亡是一种供胚胎发育及维持组织内环境稳定的基础生理过程(Raff，M．C．Nature，1992，356，397；Vaux，D．L. 等人，Cell，1994，76，777)。此重要自然过程中的不协调的特征是各种肿瘤、神经变性疾病与自身免疫性疾病的特征(Thompson，C. B．，Science，1995，267，1456)。涉及信号传导级联的生物化学属性相对较复杂且未能完全了解。各种刺激包括特异性受体例如TNFR 1或Fas的活化引发包括数种经编排以导致细胞死亡的信号成分的进化保守性执行机制(Ashkenazi，A．和Dixit，V．M．，Science，1998，181，1305)。粒酶B为一种丝氨酸蛋白酶，主要发现于细胞毒性T淋巴细胞与自然杀伤细胞的胞质颗粒中。粒酶B在通过细胞毒性细胞介导的杀伤作用诱导靶细胞凋亡性改变中起着重要作用(Huesel J．W．等人，Cell，76，977-987，1994；Shi，L.等人，J．Exp．Med．，176，1521-1529，1992)，部分是通过催化数种凯氏酶(caspase)的裂解与活化而实现(Salvesen，G．S．和Dixit，V．M．，Cell，91，443-446，1997)，也可通过不依赖凯氏酶的途径而实现(Andrade，F．等人，Immunity 8，451-460，1998)。产生的粒酶B的结构属于多肽，该多肽含有通过失活的二肽(Gly-Glu)与活性粒酶B多肽分开的引导肽。与凯氏酶类似，粒酶B特异性地识别底物上的用于裂解的天冬氨酸。TNFα是一种细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞及淋巴细胞在响应活化反应时合成。管理其表达的传统元件位于近侧或远侧启动子区中(综述于Pauli，U.，真核基因表达的重要综述，1994，4，323-344)。以下概述的是在TNFα启动子活性中起着重要作用的区a)所示的TNFα-应答性元件位于碱基对-100至-125之间。-108至-101bp区含有回文序列TGAGCTCA，其类似于含有PMA-应答性元件的AP-1序列。-125至-85bp区的多拷贝使对报道基因表达的诱导作用达7至11倍(Leitman，D．等人，J．Biol. Chem．266，9343，1991)。b)所示的PMA-应答性元件出现于-101至-286碱基对之间(Hensel，G.等人，Lymphokine Res．8，347，1989)。c)所示的抗-CD3抗体所诱导(以及Ca-离子载体所诱导)的应答性元件位于-118至-80碱基对之间。位于此区内的κB3(GGGTTTCTCC)序列对于通过Ca-离子载体TNFα启动子的CsA-敏感性活化作用具有高度重要性。就其自身的启动子来说，有人建议这些元件具有最佳功能(Goldfield，等人，J.Exp．Med．，178，1356，1993)。d)在U937细胞中，PMA应答性元件位于-95至-36bp之间，而cAMP-应答性元件(CRE)经作图位于位置-107至-99bp之间。此区对PMA无反应(Economou，J．S．等人，J．Exp．Med，170，321，1989)。e)所有三个κB部位皆与病毒-诱导型蛋白质结合，然而这些部位的缺失并不影响病毒诱导性(Goldfield，A．等人，PNAS，87，9769，1990)。而且，κB位点的缺失突变株显示其并非人类TNFα基因受PMA刺激作用的主要标靶(Goldfield，A．等人J．Exp．Med．，174，73，1991)。f)在鼠类系统中，TNFα启动子构建体-1059、-695及-655bp均为LPS强诱导型。此LPS-诱导性在-451bp构建中，尤其在-301至-241bp之间中大大降低。TNFα启动子的-1059bp片段在巨噬细胞中是沉默的，而经LPS刺激后强烈表达。活化作用的最大落差在-695至-655bp之间，其含有在鼠类TNFα启动子中的κB元件(Shakhov，A．N．等人，J．Exp．Med．，1990，171，35；Drouet，C．等人，J．Immunol.，1991，147，1694)。已知TNFα基因3′非翻译区(3′UTR)中的元件对转录后调节十分重要。已在鼠类系统中对3′UTR的影响进行了分析，其中与同源启动子结合时，LPS诱导性非常强。使用鼠类TNFα启动子系统时显示，3′UTR有效地抑制三种非-巨噬细胞的细胞系，亦即HeLa、NIH3T3及L929中的CAT活性。序列TTATTTAT在3′UTR中重复出现数次，且推测其参与调节作用(Han，J．，等人，J．Immunology，1991，146，1843-1848；Crawford，F．K．，等人，J．Biol．Chem．，1996，271，22383-22390)。各种细胞诸如活化的巨噬细胞、活化的T细胞、巨噬细胞样滑膜细胞以及成纤维细胞样滑膜细胞、转化的巨噬细胞样滑膜细胞(亦称为关节翳细胞)均出现在炎性关节中。一种称为关节翳的侵入性构造因滑膜细胞与关节翳细胞的增生而产生。关节翳可能是细胞过度增殖和／或这些细胞的凋亡减少所致。所示的这些细胞的增殖指数相对较低。因此，滑膜细胞过度增生可能是因滑膜内衬层凋亡的异常所致。滑膜中最终阶段凋亡的细胞出现的频率较低。据报导RA滑膜成纤维细胞中p53突变异常，其可能导致对凋亡的抗性。另外，滑膜组织中由位于软骨-关节翳连接处的各种类型的细胞，包括巨噬细胞谱系的细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、活化的T细胞及可能的成纤维细胞样滑膜细胞产生过量的促炎细胞因子，例如TNFα与IL-1β(Chu C．Q．等人，Arthritis ＆ Rheumatism，1991，34，1125-1132；Deleuran B．W．，等人，Arthritis & Rheumatism，1992，35，1170-1178)。这使炎性细胞长期渗入并产生更多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合核酸分子，其包含：至少一个连接至ＴＮＦα启动子上的ＴＮＦα启动子增强子区，该增强子区包含核酸ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ∶４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ∶５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ∶１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ∶１２或其保守性取代或等位基因变体；该Ｔ ＮＦα启动子进一步连接至编码粒酶Ｂ蛋白的核酸序列或其保守性取代或等位基因变体上，所述核酸序列又进一步连接至３′ＵＴＲ核酸序列上。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：雷瓦蒂J塔泰克，史蒂文D马林，兰德尔W巴顿，
申请(专利权)人：贝林格尔英格海姆药物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]