一种用于基因治疗的细胞的构建方法及制得的细胞技术

本发明专利技术公开了可用于基因治疗的细胞的构建方法，通过构建带有正常基因的修复载体、同源敲除载体，使用敲除载体敲除患者iPSC的致病基因，之后使用修复载体对iPSC进行重组修复，得到用于基因治疗的iPSC细胞。该方法可以快速，大量的修复细胞中的多类型和多个基因突变。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于基因治疗的细胞的构建方法，及使用该方法构建得到的细胞。
技术介绍
基因治疗是区别于传统药物治疗和手术治疗的一种新兴疾病疗法。主要是指利用基因工程的手段，改造遗传信息，从而起到改变疾病表形，治疗疾病的作用。自从上世纪第一例利用腺病毒载体进行的基因治疗以来，该项技术已经在全球生物医学领域得到广泛应用。虽然FDA尚未批准基因治疗，但临床前景仍很广阔。基因治疗的靶标主要是遗传性疾病，或称分子病，指的是患者的遗传信息发生改变。常见的分子病包括地中海贫血、重症肌无力等。现有的基因治疗主要策略是病毒疗法或是核酸疗法。具体来说，腺病毒应用最广。 腺病毒基因组大小适中，易于操作；同时腺病毒具有非基因组整合性，不会随宿主基因组复制而同步复制，同慢病毒或逆转录病毒相比大大提高了安全系数。细胞是病毒的天然宿主， 因此基因表达效率较常规转染手段高。核酸疗法主要是反义核酸和小分子siRNA药物。由于此类RNA分子小，易于给药，贮存方便，安全性高，已有部分通过FDA批注得以上市。现有的基因治疗方法，一般通过引入外源载体或核酸，在体内表达具有正常功能的蛋白，或使致病基因沉默，以实现基因治疗的目的。这些疗法或制剂都无法将含有致病基因的细胞修复为正常的细胞，实现真正意义上的基因治疗。由于无法将突变基因修改，也就无法实现正常的蛋白表达调控，现有的基因疗法也存在一定的风险。SiRNA虽然安全性更高，但是其应用范围有限，且需要长期用药，这也加重了客户的经济压力。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种用于基因治疗的细胞的构建方法。本专利技术的另一个目的在于提供采用上述方法构建得到的细胞。本专利技术的再一个目的在于提供一种用于可用于地中海贫血治疗的细胞的构建方法。本专利技术所采取的技术方案是一种用于基因治疗的细胞的构建方法，包括如下步骤1)将载体中引入重组酶识别序列，在识别序列间插入正常基因序列，得到修复载体；2)将正常基因序列与线性化酶切位点引入载体中，得到同源敲除载体；3)将敲除载体线性化，加入同源正常基因序列特异性的锌指核酸酶，共转染致病基因的iPSC，敲除iPSC中的突变基因，筛选出至少一条同源突变基因被敲除的阳性iPSC细胞；4)将修复载体、表达重组酶的载体共转入筛选得到的iPSC细胞，基于重组酶识别序列和重组酶，进行基因的置换修复，得到可用于基因治疗的阳性iPSC细胞。优选的，修复载体中还连接有筛选基因。优选的，同源敲除载的正常基因序列和线性化酶切位点之间插入有重组酶识别序列，重组酶识别序列之间连接有筛选基因。优选的，筛选基因为抗生素抗性基因。优选的，筛选基因两侧设有重组酶识别序列。优选的，修复载体由两种不同的修复载体组成，两种修复载体的区别在于其筛选基因不同。优选的，敲除载体由两种不同的敲除载体组成，两种敲除载体的区别在于其筛选基因不同。一种可用于β -地中海贫血治疗的细胞的构建方法,包括如下步骤1)将第一组重组酶识别序列插入到载体中，在两个识别序列之间插入正常β-地中海贫血珠蛋白基因，在识别序列和正常β-地中海贫血珠蛋白基因之间插入第二组重组酶识别序列，第二组重组酶序列中插入有抗性筛选基因，该得到修复载体对，修复载体之间的区别仅在于其抗性筛选基因不同；2)将线性化酶、地中海贫血珠蛋白基因的5’臂和3’臂插入到载体中，在5’臂和 3’臂之间插入第一组重组酶识别序列，第一组重组酶识别序列之间插入有第二组重组酶识别序列，第二组重组酶识别序列之间插入有筛选基因，第一组和第二组重组酶识别序列之间还插入有荧光蛋白序列，得到2个同源敲除载体，2个同源敲除载体之间的区别仅在于其筛选基因不同；3)将同源敲除载体线性化，加入β_地中海贫血珠蛋白基因序列特异的锌脂核酸酶， 共同转入地中海贫血患者的iPSC，加入筛选因子筛选出致病的β-地中海贫血珠蛋白基因全部被敲除的iPSC，得到阳性iPSC ；4)将修复载体、表达第一组重组酶的载体共转入筛选得到的阳性iPSC中，进行重组修复，筛选出阳性克隆细胞株，该细胞株经扩增、诱导分化即可得到用于治疗β_地中海贫血的造血干细胞。优选的，筛选出阳性克隆细胞株之后，敲除其中的筛选基因。本专利技术的有益效果是本专利技术方法可以快速，简便的得到大量的可用于基因治疗的iPSC，不同的带有致病基因的iPSC细胞可以采用基本相同的方法构建得到，有效地避免了针对特定疾病设计特定构建方法，大大减少了可用于基因治疗的细胞的难度。使用本专利技术的方法，可以在体外同时进行多位点基因突变的修复，如多位点的点突变，缺失突变等，可以快速、有效的修复患者的带病干细胞，将修复后的细胞经诱导为单能干细胞之后，回输至患者可以有效的地治疗相应的基因相关疾病，克服了现有技术操作复杂，修复效率低等缺陷。将其诱导为相应的单能干细胞之后，再注入到人体内，可以完成基因治疗。可有效地减轻患者的负担。由于使用的是患者自身的iPSC细胞，在进行基因治疗的同时，避免了使用异种细胞或载体可能对人体造成的危害。修复后的细胞受到与正常细胞相同的调控， 避免了基因过量表达或表达不足的缺陷。附图说明图I :1号打靶删除载体示意图2:2号打靶删除载体示意图3:1号修复载体示意图4:2号修复载体示意图5:3号修复载体示意图6 :4号修复载体不意图。具体实施例方式一种用于基因治疗的细胞的构建方法，包括如下步骤1)将载体中引入重组酶识别序列，在识别序列间插入正常基因序列，得到修复载体；2)将正常基因序列与线性化酶切位点引入载体中，得到同源敲除载体；3)将敲除载体线性化，加入同源正常基因序列特异性的锌指核酸酶，共转染致病基因的iPSC，敲除iPSC中的突变基因，筛选出至少一条同源突变基因被敲除的阳性iPSC细胞；4)将修复载体、表达重组酶的载体共转入筛选得到的iPSC细胞，基于重组酶识别序列和重组酶，进行基因的置换修复，得到可用于基因治疗的阳性iPSC细胞。优选的，修复载体中还连接有筛选基因。优选的，同源敲除载的正常基因序列和线性化酶切位点之间插入有重组酶识别序列，重组酶识别序列之间连接有筛选基因。通过插入筛选基因，可以方便地通过设置筛选条件，筛选出所需要的阳性细胞，大大简化了筛选的难度。优选的，筛选基因为抗生素抗性基因，这样就可以简单通过在培养基中添加相应的抗生素来筛选出所需要的细胞。优选的，筛选基因两侧设有重组酶识别序列。这样可以简单通过加入重组酶或表达重组酶的载体，对重组酶识别序列之间的筛选基因进行替换，大大降低了修复载体、敲除载体构建时的工作量，有利于快速、简便地替换不同的筛选基因。优选的，修复载体由两种不同的修复载体组成，两种修复载体的区别在于其筛选基因不同。优选的，修复载体和/或同源敲除载体中还插入有荧光蛋白基因，这样可以简单通过荧光检测，判断所需要的核酸序列是否已经表达，进而筛选出所需要的细胞，或者选择出修复后可更好表达的细胞。优选的，敲除载体由两种不同的敲除载体组成，两种敲除载体的区别在于其筛选基因不同。通过使用不同的筛选基因，同时添加多种筛选条件，可以方便的得到同源基因都被删除或修复的细胞。为避免将筛选基因，特别是抗生素抗性基因引入患者体内造成潜在的危害，将最终得到的阳性iPSC细胞中的筛选基因敲除。一种可用于β -地中海贫血治疗的细胞的构建方法,包括如下步骤I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴东海，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：