本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2‑1蛋白细胞株及其构建方法，该细胞株整合了呼吸道合胞病毒M2‑1基因，能稳定高效的表达呼吸道合胞病毒M2‑1基因。该构建方法包括如下步骤：利用基因重组技术将呼吸道合胞病毒M2‑1基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中；将构建好的重组表达载体pcDNA‑M2‑1转染Hep‑2细胞，通过G418筛选出阳性细胞株；对阳性细胞株进行RT‑qPCR和Western blot鉴定。本发明专利技术的细胞株可以为临床病毒分离培养提供快速、灵敏、稳定的平台，并为研究M2‑1的转录延长因子的特性奠定了工作基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株及其构建方法。
技术介绍
呼吸道传染病是人类感染性疾病中最主要疾病之一，近30年新发传染病中，约60%都是由呼吸道病毒感染引起，急性呼吸道病毒感染是各年龄段人群重要发病和病死原因。病毒分离培养是鉴定病毒感染的“金标准”，也是病毒后续深入研究中必不可少的一环。M2-1是由呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）基因组中M2基因第一个开放阅读框编码的蛋白，是一种重要的转录抗终止因子，有提高转录效率，增加全长mRNA产量，并促进细胞增值的作用，且体外实验证实其对RNA序列没有特异性要求。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株，该细胞株可以为临床病毒分离培养提供快速、灵敏、稳定的平台，并为研究M2-1的转录延长因子的特性奠定了工作基础。本专利技术的另一目的在于提供一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株的构建方法，该构建方法成功构建了稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白的细胞株，操作简便。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株，该细胞株整合了呼吸道合胞病毒M2-1基因，能稳定高效的表达呼吸道合胞病毒M2-1基因。本专利技术的另一目的通过下述技术方案实现：一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株的构建方法，包括如下步骤：（1）利用基因重组技术将呼吸道合胞病毒M2-1基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中，得到重组表达载体pcDNA-M2-1；（2）将构建好的重组表达载体pcDNA-M2-1转染Hep-2细胞，通过G418筛选出阳性细胞株；（3）对阳性细胞株进行RT-qPCR和Western blot鉴定，得到稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株。优选的，所述步骤（1）具体为：先根据呼吸道合胞病毒M2-1基因，设计带有BamHI和XbaI双酶切位点及保护碱基的呼吸道合胞病毒M2-1特异引物，再通过RT-PCR反应扩增呼吸道合胞病毒M2-1基因，然后在pcDNA3.1(+)载体的BamHI和XbaI多克隆位点插入呼吸道合胞病毒M2-1基因，得到重组表达载体pcDNA-M2-1。优选的，所述特异引物的序列为：上游引物F：5’-AAAGGATCCATGTCACGAAGGAATCCTTGCA-3’下游引物R：5’-AAATCTAGATCAGGTAGTATCATTATTTTTGGCATG-3’。优选的，所述RT-PCR的反应体系为：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL、2×1 Step Buffer 25μL、RSV-LONG 基因组RNA 0.5μg、上游引物F 0.4μL和下游引物R 0.4μL，ddH2O补齐至20μL。优选的，所述步骤（2）具体为：将构建好的重组表达载体pcDNA-M2-1先通过脂质体转染的方式转染Hep-2细胞，再通过含G418的培养基筛选出阳性细胞株。优选的，所述步骤（3）中，得到稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株冻存于液氮中。优选的，所述步骤（3）中，RT-qPCR的鉴定引物为：上游引物F：5’-GCAGAGTTGGACAGAACAGAAGAGTAT-3’下游引物R：5’-ACTATTGAGTTCAGTGAGGAGTTTGCT-3’。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的细胞株可以为临床病毒分离培养提供快速、灵敏、稳定的平台，并为研究M2-1的转录延长因子的特性奠定了工作基础。本专利技术的构建方法成功构建了稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白的细胞株，操作简便。附图说明图1是呼吸道合胞病毒M2-1的扩增电泳图。图2是重组表达载体pcDNA-M2-1的构建电泳图。图3是重组表达载体pcDNA-M2-1的构建图谱。图4是重组表达载体pcDNA-M2-1的测序图。图5是稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株的RT-qPCR鉴定图。图6是稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株的Western blot鉴定图。图7是Hep-2-2F5细胞增殖分析图。具体实施方式为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-7对本专利技术作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本专利技术的限定。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。见图1-7，一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株，该细胞株整合了呼吸道合胞病毒M2-1基因，能稳定高效的表达呼吸道合胞病毒M2-1基因。一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株的构建方法，包括如下步骤：（1）利用基因重组技术将呼吸道合胞病毒M2-1基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中，得到重组表达载体pcDNA-M2-1；（2）将构建好的重组表达载体pcDNA-M2-1转染Hep-2细胞，通过G418筛选出阳性细胞株；（3）对阳性细胞株进行RT-qPCR和Western blot鉴定，得到稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株。所述步骤（1）具体为：先根据呼吸道合胞病毒M2-1基因，设计带有BamHI和XbaI双酶切位点及保护碱基的呼吸道合胞病毒M2-1特异引物，再通过RT-PCR反应扩增呼吸道合胞病毒M2-1基因，然后在pcDNA3.1(+)载体的BamHI和XbaI多克隆位点插入呼吸道合胞病毒M2-1基因，得到重组表达载体pcDNA-M2-1。所述步骤（1）具体包括如下步骤：1、RT-PCR扩增呼吸道合胞病毒M2-1基因根据呼吸道合胞病毒M2-1基因，设计带有BamHI和XbaI双酶切位点及保护碱基的RSV M2-1特异引物，再通过RT-PCR反应扩增呼吸道合胞病毒M2-1基因。所述M2-1的基因序列为：ATGTCACGAAGGAATCCTTGCAAATTTGAAATTCGAGGTCATTGCTTGAATGGTAAGAGATGTCATTTTAGTCATAATTATTTTGAATGGCCACCCCATGCACTGCTCGTAAGACAAAACTTTATGTTAAACAGAATACTTAAGTCTATGGATAAAAGTATAGATACCTTATCAGAAATAAGTGGAGCTGCAGAGTTGGACAGAACAGAAGAGTATGCTCTTGGTGTAGTTGGAGTGCTAGAGAGTTATATAGGATCAATAAATAATATAACTAAACAATCAGCATGTGTTGCCATGAGCAAACTCCTCACTGAACTCAATAGTGATGATATCAAAAAACTGAGAGACAATGAAGAGCTAAATTCACCCAAGATAAGAGTGTACAATACTGTCATATCATATATTGAAAGCAACAGGAAAAACAATAAACAAACTATCCATCTGTTAAAAAGATTGCCAGCAGACGTATTGAAGAAAACCATCAAAAACACATTGGATATCCACAAGAGCATAACCATCAACAACCCAAAAGAATTAACTGTTAGTGATACAAATGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2‑1蛋白细胞株，其特征在于：该细胞株整合了呼吸道合胞病毒M2‑1基因，能稳定高效的表达呼吸道合胞病毒M2‑1基因。
【技术特征摘要】
1.一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株，其特征在于：该细胞株整合了呼吸道合胞病毒M2-1基因，能稳定高效的表达呼吸道合胞病毒M2-1基因。2.如权利要求1所述的一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）利用基因重组技术将呼吸道合胞病毒M2-1基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中，得到重组表达载体pcDNA-M2-1；（2）将构建好的重组表达载体pcDNA-M2-1转染Hep-2细胞，通过G418筛选出阳性细胞株；（3）对阳性细胞株进行RT-qPCR和Western blot鉴定，得到稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株。3.根据权利要求2所述的一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）具体为：先根据呼吸道合胞病毒M2-1基因，设计带有BamHI和XbaI双酶切位点及保护碱基的呼吸道合胞病毒M2-1特异引物，再通过RT-PCR反应扩增呼吸道合胞病毒M2-1基因，然后在pcDNA3.1(+)载体的BamHI和XbaI多克隆位点插入呼吸道合胞病毒M2-1基因，得到重组表达载体pcDNA-M2-1。4.根据权利要求3所述的一种稳定表达呼吸道合胞病毒M2-1蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：所述特异引物的序列为：上游引物F：5’-AAAGGATCCATGTCACGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，钟柏茂，陆小梅，何晓光，马强，彭琪，谢明玉，
申请(专利权)人：东莞市儿童医院，东莞市儿科研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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