本发明专利技术提供一株抗K亚群禽白血病病毒(ALV‑K)的细胞系及其应用。将ALV‑K env基因插入表达载体，将构建的转移载体在鸡胚成纤维细胞系DF‑1中表达，通过Zeocin药物筛选获得有Zeocin抗性、稳定表达ALV‑K env基因的鸡胚成纤维细胞系DF‑1/K，该细胞系保藏编号为CCTCC No.C201610。对DF‑1/K细胞系进行检测和抗病毒感染分析，发现DF‑1细胞系中表达的ALV‑K env蛋白对ALV‑K病毒具有超感染抗性，能抵抗滴度为104TCID50的病毒感染复制量，本发明专利技术的DF‑1/K细胞系可用于不同亚群禽白血病病毒感染的鉴别诊断，临床诊断价值显著，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学领域，具体地，涉及一株抗K亚群禽白血病病毒的细胞系及其应用。
技术介绍
禽白血病病毒(ALV)属于反转录病毒科禽α型反转录病毒群，。禽白血病病毒与肉瘤病毒紧密相关，常统称为禽白血病/肉瘤病毒。根据细胞感染范围、干扰谱和囊膜抗原特征，过去常将禽白血病/肉瘤病毒群进一步区分为A到J等10个亚群，其中A、B、C、D、E、J亚群主要见于鸡。A、B、J亚群是常见的外源性病毒,C、D亚群是极少报道的外源性病毒。近年来在一些中国地方鸡品系中新发现了K亚群禽白血病病毒。禽白血病病毒囊膜蛋白(env基因编码的病毒糖基化蛋白)是该类病毒的主要表面蛋白，它决定病毒感染的宿主范围，能诱导产生中和抗体。该蛋白与靶细胞表面特异性受体识别、结合，是病毒进入细胞，复制所必需的。感染特定亚群ALV后，细胞表面病毒受体能被该病毒产生的env基因编码的病毒糖基化蛋白封闭，表现出强大的超感染抗性，能限制相应病毒的再次感染。目前禽白血病对我国养禽业的危害严重，并出现了髓细胞瘤型和血管瘤型等多种病理表现型，在临床表现上还容易与网状内皮组织增生症、马立克氏病等肿瘤性疾病相混淆。该病主要为垂直传播，控制本病有效的措施是降低种鸡群的感染率和建立无白血病的种鸡群，其主要手段是通过对鸡群定期进行外源性ALV检测，及时淘汰带毒阳性鸡，以净化和消除鸡群中的ALV。在外源性ALV中，以J亚群、A亚群和B亚群禽白血病病毒对鸡有明显的致病性，对养禽
生产的危害也大，而新发现的K亚群也属于外源性禽白血病病毒，可能一直存在于我国地方品系鸡群，且已在我国很多地方都分离到该亚群。国内外对于禽白血病病毒的检测和鉴定方法主要有细胞培养、ELISA、间接免疫荧光试验、PCR等，其中ELISA在临床上应用最广，其优点是该法操作相对简便，有商品化的检测试剂盒可以利用，其不足之处是不能区分内源性和外源性ALV；间接免疫荧光试验比较直观，但是往往需要用到特异性抗体(单抗)。能够区分不同ALV亚群的PCR引物及其工作体系已经有报道，但由于K亚群禽白血病病毒为新发现亚群，其鉴别诊断技术还不完善，没有特异性单克隆抗体等，目前主要通过PCR技术，后送测序的方法区分亚群。在外源性禽白血病病毒的分离上，目前常用的细胞有鸡胚成纤维细胞(CEF)和源于0系鸡的成纤维细胞系DF-1。美国ADOL实验室基于DF1细胞系建立了抗J亚群禽白血病病毒的DF-1/J细胞系。尽管美国ADOL实验室有一些特定的鸡品系，其产生的原代细胞可以分别限制特定外源性禽白血病病毒生长，但是这些品系鸡的稀有性限制了其效能的发挥。目前国内外均没有可特异性地限制K亚群禽白血病病毒的细胞系的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株特异性的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系。本专利技术的另一目的在于提供上述抗K亚群禽白血病病毒的细胞系的应用。本专利技术的抗K亚群禽白血病病毒细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)利用带BamHI和NotI酶切位点的引物从ALV-K(GDFX0601毒株)基因组PCR扩增env片段，用限制性内切
酶BamHI和NotI分别对扩增的env基因及真核表达质粒pcDNA3.1/Zeo(+)进行双酶切，分别纯化后将K亚群禽白血病病毒env基因片段连接到pcDNA3.1/Zeo(+)真核表达质粒，构建成重组质粒pcDNA-env-K；(2)转移载体pcDNA-env-K在DF-1鸡胚成纤维细胞系表达的基础上，通过Zeocin药物多次筛选，得到具有Zeocin抗性、可稳定表达ALV-K env蛋白的鸡胚成纤维细胞系DF-1/K，即抗K亚群禽白血病病毒的细胞系。本专利技术筛选得到的抗K亚群禽白血病病毒鸡胚成纤维细胞，命名为DF-1/K，于2016年1月21日在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，邮编430072)保藏，保藏编号CCTCC No.C201610。本专利技术保藏编号为CCTCC No.C201610的细胞系可用于制备ALV-K单克隆抗体。进一步，本专利技术提供一种ALV-K单克隆抗体，其由保藏编号为CCTCC No.C201610的细胞系制备得到。本专利技术提供了保藏编号为CCTCC No.C201610的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系在制备K亚群禽白血病病毒诊断试剂中的应用。本专利技术提供了保藏编号为CCTCC No.C201610的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系在制备K亚群禽白血病病毒抗体检测试剂中的应用。本专利技术提供了保藏编号为CCTCC No.C201610的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系在制备K亚群禽白血病病毒生物制品中的应用。所述生物制品为疫苗。本专利技术提供了保藏编号为CCTCC No.C201610的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系在制备抗K亚群禽白血病转基因鸡中的应用。本专利技术还提供了一种用于检测K亚群禽白血病病毒的试剂，含有保藏编号为CCTCC No.C201610的抗K亚群禽白血病病毒的细胞
系。本专利技术的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系可应用于K亚群禽白血病病毒的诊断。本专利技术提供了一种用于检测K亚群禽白血病病毒的试剂盒，含有K亚群禽白血病病毒单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCC No.C201610的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系制备得到。本专利技术提供了一种用于检测K亚群禽白血病病毒抗体的试剂盒，含有K亚群禽白血病病毒单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCC No.C201610的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系制备得到。本专利技术提供了用于检测抗K亚群禽白血病病毒的细胞系的特异性引物对，其上下游引物序列分别为：上游引物：CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGATAC下游引物：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCATTTTCG。目标片段大小约1791bp。含有上述特异性引物对的试剂盒属于本专利技术的保护范围。本专利技术从ALV env蛋白超感染抗性出发，将K亚群禽白血病病毒env基因插入pcDNA3.1/Zeo(+)真核表达载体构建成转移载体pcDNA-env-K，然后将载体pcDNA-env-K转染鸡胚成纤维细胞系DF-1，通过药物Zeocin筛选，获得抗Zeocin、稳定表达ALV-K env蛋白的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系。所得到的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系可以稳定传代，长期保存；能抵抗滴度为104TCID50的病毒感染复制量，特异性强，本专利技术的DF-1/K细胞系可用于K亚群禽白血病病毒的诊断以及ALV-K疫苗的研制。附图说明图1为抗K亚群禽白血病病毒的细胞系构建的技术路线图2为正常DF-1细胞状态：纤维状，梭形，贴壁生长。图3为PCR检测DF-1/K中env基因结果，用本专利技术设计的引物在DF-1/K中成功检测到1791bp的env基因，而DF-1中没有。图4为间接免疫荧光(IFA)检测env基因表达情况结果，其中图4A为DF-1细胞(阴性对照)无绿色荧光，图4B为DF-1/K细胞有绿色荧光，说明外源env基因片段在DF-1/K中成功表达。图5为Western-blot检测env基因的表达结果，DF-1/K中有en本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株抗K亚群禽白血病病毒的细胞系，其为鸡胚成纤维细胞，名为DF‑1/K，其保藏编号为CCTCC No.C201610。
【技术特征摘要】
1.一株抗K亚群禽白血病病毒的细胞系，其为鸡胚成纤维细胞，名为DF-1/K，其保藏编号为CCTCC No.C201610。2.权利要求1所述的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系在制备K亚群禽白血病病毒诊断试剂中的应用。3.权利要求1所述的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系在制备K亚群禽白血病病毒抗体检测试剂中的应用。4.权利要求1所述的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系在制备K亚群禽白血病病毒单克隆抗体中的应用。5.一种K亚群禽白血病病毒单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCC No.C201610的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系制备得到。6.权利要求1所述的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹伟胜，饶明章，袁丽霞，廖明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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