一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体涉及一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物、探针、试剂盒及方法，该引物包括分别用于扩增HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4对共8条引物；该探针包括分别用于检测HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4条探针；该试剂盒包括上述所述的引物和上述所述的探针。本发明专利技术具有准确、灵敏、窗口期短、效率高等优点，操作相对简便，可降低母婴垂直传播疾病的发病率。

【技术实现步骤摘要】
一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物、探针、试剂盒及方法
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）1型和2型、细小病毒B19（B19）是导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的四种常见的人类疱疹病毒。这些病原体感染母体后，引起母体的相关症状并不明显，但可通过胎盘垂直传播给胎儿，从而引起胎儿及新生儿的严重后遗症。新生儿感染的临床症状取决于病毒类型和感染时的胎龄，胎儿感染病毒的风险通常与胎龄呈现负相关，感染后可引起新生儿肺炎、听力异常、高胆红素血症等多器官损伤，也可能累及神经系统造成不同程度的智力障碍及各种瘫痪、失明、失聪等严重后遗症。因此，通过这四种病毒的筛查和监测减少母婴传播是防止胎儿宫内感染的重要手段，可减少先天性感染及降低围产期发病率和死亡率，减少出生缺陷，提高出生人口素质。目前，国内外对于巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19的检测技术主要包括电子显微镜技术、细胞培养技术、免疫学技术等。这些技术各具特点，但因在临床上受灵敏度、特异性、检测周期等问题而未能在临床推广应用。实时荧光定量PCR技术的出现，为病毒检测提供了一种简单快速、特异性强、灵敏度高的方法，因此在临床检测上得到广泛应用。因此，该方法广泛应用于临床分子诊断，大大缩短了检测时间，提高了检测灵敏度和特异性。在核酸单重荧光定量检测领域，国外已经有针对这四种病毒的检测方法。多重检测领域，有利用核酸杂交方法对巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）、水痘带状疱疹病毒（VZV）、EB病毒（EBV）和人疱疹病毒6型（HHV-6）进行同步扩增检测的方法。Markoulatos等人采用多重PCR结合电泳分析的方法对MV、HSV-1、HSV-2、VZV和EBV进行检测。Leveque等人利用多重PCR扩增结合DNA芯片对HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8和人肠道病毒（HEVs）进行检测。在国内，有针对HSV、HPV的荧光定量PCR多重检测的报道。由此可见，针对多种病毒的多重PCR反应技术已经是相当成熟，但未见这四种病毒的多重荧光定量PCR方法的报道。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，该引物能满足多个待检样品在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。本专利技术的另一个目的在于提供一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的探针，该探针特异性好，检测灵敏精确。本专利技术的还一个目的在于提供一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的试剂盒，该试剂盒能同步实时检测血液、体液或者分泌物标本中巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19核酸是否存在，准确性好，灵敏度高。本专利技术的还一个目的在于提供一种含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原体检测序列的阳性质粒的制备方法，该制备方法步骤简单，操作控制方便，质量稳定。本专利技术的还一个目的在于提供一种含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原体检测序列的阳性质粒，该阳性质粒的检测准确性好，灵敏度高。本专利技术的还一个目的在于提供一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的方法，该方法具有准确、灵敏、窗口期短、效率高等优点，操作相对简便，可降低母婴垂直传播疾病的发病率。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，包括分别用于扩增HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4对共8条引物，8条引物分别简写为F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4和R4；其中，F1和R1的扩增区域位于HCMV病毒全基因序列的110779-110853nt，F2和R2的扩增区域位于HSV1病毒全基因序列的25851-25976nt，F3和R3的扩增区域位于HSV2病毒全基因序列的29401-29487nt，F4和R4的扩增区域位于B19病毒全基因序列的2975-3082nt。优选的，所述8条引物的序列分别为：F1：5’-TCGGTCAGATCTACCTGGTTCA-3’R1：5’-TGTATTCCATATGCCTCGATGTCT-3’F2：5’-GTCCCGAGGACAGACGAGAATA-3’R2：5’-CGGCGCTTTATYTTCCACG-3’F3：5’-CCCAACGCAACGCCTACTAC-3’R3：5’-GCACGAAGTGAACCAACTGC-3’F4：5’-CCTGGGCAAGTTAGCRTACAA-3’R4：5’-ATGAATCCTTGCAGCACTGTCM-3’。一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的探针，包括分别用于检测HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4条探针。优选的，所述4条探针分别简写为T1、T2、T3和T4，4条探针的序列分别为：T1：5’-CTCCGCCAGAGGACCCGCAA-3’T2：5’-CATGAGGACCCCACACGTATGCACG-3’T3：5’-TTTCAGGCCCTGCACCGCTCC-3’T4：5’-ACTAACTATRTTGGGCCTGG-3’。各引物和探针的设计如下：1、针对HCMV的UL75基因，设计的扩增序列长度为75bp，位于病毒全基因序列的110779-11085nt之间（参考序列为KR534208.1），Taqman探针荧光基团为5`HEX，淬灭基团为3`BHQ1，扩增序列如下：TCGGTCAGATCTACCTGGTTCAGAAACTGCTCCGCCAGAGGACCCGCAAAAAGACATCGAGGCATATGGAATACA。2、针对HSV1的UL12基因，设计的扩增序列长度为126bp，位于病毒全基因序列的25851-25976nt之间（参考序列为FJ593289.1），Taqman探针荧光基团为5`ROX，淬灭基团为3`BHQ2，扩增序列如下：GTCCCGAGGACAGACGAGAATATCCAGGGACGCCCCGACCATCCCCGTGTGACCGTCCATGAGGACCCCACACGTATGCACGTTCTCTTCGGCGAGGTCGCTGGGTTCGTGGAAGATAAAGCGCCG。3、针对HSV2的UL15基因，设计的扩增序列长度为87bp，位于病毒全基因序列的29401-29487nt之间（参考序列为JN561323.2），Taqman探针荧光基团为5`CY5，淬灭基团为3`BHQ2，扩增序列如下：CCCAACGCAACGCCTACTACAGCGTCCTGAACACGTTTCAGGCCCTGCACCGCTCCGAAGCCTTTCGGCAGTTGGTTCACTTCGTGC。4、针对B19的VP1基因，设计的扩增序列长度为108bp，位于病毒全基因序列的2975-3082nt本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，其特征在于：包括分别用于扩增HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4对共8条引物，8条引物分别简写为F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4和R4；其中，F1和R1的扩增区域位于HCMV病毒全基因序列的110779‑110853nt，F2和R2的扩增区域位于HSV1病毒全基因序列的25851‑25976nt，F3和R3的扩增区域位于HSV2病毒全基因序列的29401‑29487nt，F4和R4的扩增区域位于B19病毒全基因序列的2975‑3082nt。

【技术特征摘要】
1.一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，其特征在于：包括分别用于扩增HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4对共8条引物，8条引物分别简写为F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4和R4；其中，F1和R1的扩增区域位于HCMV病毒全基因序列的110779-110853nt，F2和R2的扩增区域位于HSV1病毒全基因序列的25851-25976nt，F3和R3的扩增区域位于HSV2病毒全基因序列的29401-29487nt，F4和R4的扩增区域位于B19病毒全基因序列的2975-3082nt。2.根据权利要求1所述的一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，其特征在于：所述8条引物的序列分别为：F1：5’-TCGGTCAGATCTACCTGGTTCA-3’R1：5’-TGTATTCCATATGCCTCGATGTCT-3’F2：5’-GTCCCGAGGACAGACGAGAATA-3’R2：5’-CGGCGCTTTATYTTCCACG-3’F3：5’-CCCAACGCAACGCCTACTAC-3’R3：5’-GCACGAAGTGAACCAACTGC-3’F4：5’-CCTGGGCAAGTTAGCRTACAA-3’R4：5’-ATGAATCCTTGCAGCACTGTCM-3’。3.一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的探针，其特征在于：包括分别用于检测HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4条探针。4.根据权利要求3所述的一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的探针，其特征在于：所述4条探针分别简写为T1、T2、T3和T4，4条探针的序列分别为：T1：5’-CTCCGCCAGAGGACCCGCAA-3’T2：5’-CATGAGGACCCCACACGTATGCACG-3’T3：5’-TTTCAGGCCCTGCACCGCTCC-3’T4：5’-ACTAACTATRTTGGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎四平，马强，李文瑞，陆小梅，钟柏茂，张守涛，
申请(专利权)人：东莞市儿童医院，东莞市儿科研究所，郑州大学，
类型：发明
国别省市：广东,44