本发明专利技术公开了一种鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包含恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明专利技术的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；核酸扩增反应全部恒定同一温度，恒温扩增仅需30分钟，核酸试纸条检测结果需1-2分钟，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需40分钟左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合鸡肉源性成分核酸的现场快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种针对鸡肉源性成分核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对鸡肉源 性成分核酸的现场快速定性检测。 (二）
技术介绍
我国肉类产量逐年增加，其中鸡肉产量占据肉类总产量的13.97%。与此同时，消 费者对食品质量与安全性的要求也越来越高，不法商贩、企业为获得非法利润，常以较低价 的鸡肉冒充牛、羊、猪肉，严重侵害了消费者利益。这不仅涉及经济、营养价值和食品安全等 问题，更直接影响消费者的健康，尤其是对某些食物过敏的消费者。为维护广大消费者合法 权益，稳定市场秩序，对动物性食品进行种源的鉴定显得十分必要。目前，在动物种源的定性检测的常规检测方法，如电泳、免疫学技术、光谱技术等 存在很大缺陷，如灵敏度低、周期长、费时费力等，因此其应用仍存在一定的局限性。本专利技术 技术研制了恒温扩增鸡肉源性成分核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个 反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的 可能性。研究表明该鸡肉源性成分核酸的恒温扩增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、 敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，所以非常适用在基层检验机构使用，同时 在农贸市场的现场检测上也具有很好的应用前景。 (三）
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检 测试剂盒及其检测方法。 本专利技术采用的技术方案是： 本专利技术提供一种鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下 组成： (1)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩 增引物、lXThermolbuffer、MgS04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；其中： 所述的外围引物分别为： 正向外围引物为：5，-TCTCCCATGGGGCCAAAT-3'(SEQIDNO. 2)； 反向外围引物为：5' -TAGGAAGGTGAGGTGGATGA-3'(SEQIDNO. 3)； 所述两条探针的序列分别为： 正向 5' 端Biotin标记探针：5' -Biotin-GTCCAATGTAGGGAATTGCTG-3'(SEQID NO. 4)； 反向 5 '端Fite标记探针：5 ' -Fitc-GTAAGGCGAAGAATCGGGA-3 '(SEQID NO. 5)； 所述两条扩增交叉引物分别为： 扩增正向引物： 5r -TCCCCCTCAGGCTCACTCTACTCTGAGGGGCCACCGTTAT-3r(SEQIDNO. 6)； 扩增反向引物： 5r -TTCAGTCGACAACCCAACCCTTCGATTGCAAAGGGGAGGAG-3r(SEQIDNO. 7)； (2)阳性对照：含有鸡属特异性的细胞色素b基因（Cytb基因）片段的DNA质粒； ⑶阴性对照：无菌双蒸水。 进一步，本专利技术所述的 1XThermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的 KCl、10mM的（NH4)2S04、2mM的MgS04&及质量浓度为 0.1% 的TritonΧ-100，ρΗ7·8。 进一步，本专利技术所述阳性对照为含有长205bp的鸡属特异性的Cytb基因序列的片 段，所述片段的核苷酸序列如下（SEQIDNO. 1): 进一步，本专利技术所述阳性对照按如下步骤制备： 以包含扩增区域的鸡属特异性的Cytb基因片段为模板，通过两条外围引物进行 PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒（Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯 化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒（Promega)构建完整的含有目的基因的质 粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A2S。定量并稀释至10个拷贝/μ1，获得阳性对 照，-20 °C保存。 进一步，本专利技术所述恒温PCR扩增反应液组成为：两条外围引物各自5. 7nmol， 两条探针各自11.4nmol，两条交叉引物各自22. 8nmol，lXThermolbuffei^MgSO^^ 0. 2μmol，dNTPs溶液各35pmol，BstDNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μ1。 本专利技术还提供一种所述鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒的检测方法，所 述检测方法为：a)提取待检测标本DNA:剪取约米粒大小的鸡肉样品，加入500 μL双蒸水后振荡 15s，于95°C作用5min，离心后取上清，即获得DNA; b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在 65°C下扩增反应30分钟；标准阳性模板（即阳性对照）加入阳性对照PCR管中，标准阴性 模板（即阴性对照）加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有鸡属特异性的Cytb 基因片段的DNA质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水； c)将反应后的PCR管采用核酸试纸条进行检测（优选放置到核酸试纸条防污染检 测装置（杭州优思达生物技术公司3号装置）中进行检测），2分钟以后判读结果，当试纸 条的检测线呈阳性时（即试纸条T线为红色，C线为红色），说明样品中含有鸡肉源性成分 核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序设有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水 滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合 物垫上的有色颗粒有抗Fite抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗Fite抗体包 被，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。 在本专利技术提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试 剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA 合成不断的自我扩增循环。在本专利技术提供的鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒中， 对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本 专利技术与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了鸡肉源性成分核酸的恒温扩增定性检测的 方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10个拷贝，可以满足快速检测鸡肉源性 成分核酸的要求。 本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果： (1)本专利技术简化了肉样品核酸的提取方法，减低了成本，而且大大缩短了检测时 间。 (2)鸡肉恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高； (3)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需40分钟左右； (4)整个扩增和检测过程中不需要打开管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个 反应过程不需要复杂的仪器。 (四）【附图说明】 图1为核酸检测试纸条原理示意图。 图2为本专利技术试剂盒用于检测鸡肉源性成分核酸的特异性，图中1-7分别鸡肉、鸭 肉、猪肉、牛肉、羊肉、阳性对照、阴性对照品。 图3为本专利技术试剂盒用于检测鸡肉源性成分核酸的灵敏度，图中1-6分别表示10 4 拷贝/微升、1〇3拷贝/微升、10 2拷贝/微升、10 1拷贝/微升、10 °拷贝/微升、阴性对照品。 (五）【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：(1)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×Thermol Buffer，MgSO4，dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；所述正向外围引物为：5′‑TCTCCCATGGGGCCAAAT‑3′；反向外围引物为：5′‑TAGGAAGGTG AGGTGGATGA‑3′；所述两条探针的序列分别为：正向5′端Biotin标记探针：5′‑Biotin‑GTCCAATGTAGGGAATTGCTG‑3′；反向5′端Fitc标记探针：5′‑Fitc‑GTAAGGCGAAGAATCGGGA‑3′；所述两条扩增交叉引物分别为：扩增正向引物：5′‑TCCCCCTCAGGCTCACTCTACT‑CTGAGGGGCCACCGTTAT‑3′；扩增反向引物：5′‑TTCAGTCGACAACCCAACCCTT‑CGATTGCAAAGGGGAGGAG‑3′；(2)阳性对照：含有鸡属特异性的细胞色素b基因Cytb的DNA质粒；(3)阴性对照：无菌双蒸水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐昌平，须周恒，史亚，冯燕，卢亦愚，胡宗悦，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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