使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸制造技术

本发明专利技术提供了一种扩增靶核酸序列或信号的方法，其中所用的扩增反应混合物中含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸。此非羟基3’端可以在一种化学物质和/或辐射和/或温度范围作用下转化为羟基3’端。本发明专利技术还提供了一种如上所述的可逆修饰寡核苷酸，此外还提供了含有这种寡核苷酸的核酸扩增反应混合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
本申请为分案申请，其原申请的申请日为2007年7月30日，申请号为200780028773.9，名称为“使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸”。本专利申请要求以2007年7月31日提交的美国专利No.60/834,41作为优先权基础。
本专利技术主要涉及核酸化学领域，更具体而言，本专利技术涉及扩增核酸序列或信号的方法和减少非特异性扩增的方法。
技术介绍
核酸扩增技术已被广泛应用于临床微生物学、血液检测、食品安全、遗传病的诊断与预后、环境微生物学、药物靶点发现和鉴定、法医学以及其他生物医学方面的研究。其中核酸扩增的简易高效性、特异性、灵敏度、准确度、精确度，以及经济可承受性至关重要。核酸序列特异性扩增可以对特定序列进行灵敏的检测。聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)是两种热循环扩增技术。相比PCR和LCR,等温扩增技术是一种在基本不变的温度下进行的扩增方法。转录介导扩增(Transcription-mediatedamplification，TMA)、基于核酸序列扩增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)、链置换扩增(strand-displacementamplifeation，SDA)、滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)、单引物等温扩增(singleprimerisothermalamplificatio，SPIATM)、指数单引物等温扩增(exponentialsingleprimerisothermalamplification，X-SPIATM)、自主序列复制系统(self-sustainedsequencereplication，3SR)和环介导等温核酸扩增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)均为等温扩增的具体实例。核酸序列也可通过信号扩增过程来检测，比如循环探针技术(cyclingprobe)和侵入检测(InvaderAssay)。当杂交探针被核酸酶切除时，将会产生可检测的信号。由于所有的酶，无论其耐热性如何，都在一定的温度范围内具有活性，这样的性质会在其特异性、灵敏性、信噪比等方面对核酸扩增产生负面影响。这已在PCR过程中被明确地证实。耐热DNA聚合酶对PCR而言是必不可少的。虽然耐热DNA聚合酶活性最高的温度在60-75℃，但在低温下它依然具有活性。即使在室温下它也仍然具有明显的活性。但是其低温时的活性将会导致引物二聚体的形成和非特异性的扩增，从而降低检测灵敏度。使用热启动(hot-start)技术可以提高DNAPCR的效果。热启动技术是指任何具有下述特征的组装PCR反应的方法，即通过物理或化学方法使得在低温下反应组分中的一种或多种成分与其他成分分离开来，而在高温下使得反应发生。热启动PCR技术分为以下几种：1.通过物理屏障分隔将必需组分分隔为至少两部分，如美国专利5,411,876、5,565,339、5,413,924和5,643,764所述(上述文献均通过援引的方式纳入本文)。该屏障可通过高温加热来消除。2.使用可逆酶抑制剂来抑制酶在低温下的活性，如美国专利5,338,671、5,677,152、5,773,258、6,183,998、5,693,502、5,874,557、5,763,173、6,020,130和6,183,967中所述(上述文献均通过援引的方式纳入本文)。与抑制剂的结合方式是非共价的或共价的。这些方法的热启动技术是在均一相中进行，这类技术也是目前最为广泛使用的。3.辅助因子的相分离法，如美国专利6,403,341所述(该文献通过援引的方式纳入本文)。Mg2+在低温下会沉淀，并会随着温度的上升而溶解。一步法RTPCR(One-stepRTPCR)是在一个反应容器中连续完成RNA分子的逆转录过程与互补性cDNA分子的扩增过程，从而实现扩增靶点RNA的方法。靶点RNA分子包括艾滋病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、西尼罗河脑膜炎病毒(WNV)、人类流感病毒、禽流感病毒、登革病毒、埃博拉病毒等。在美国，检测捐血者血液中是否存在HIV，HBV，HCV和WNV是强制性的。一步法RTPCR在这些临床检验以及血液检测时有重要的作用。遗憾的是，目前没有一种热启动技术可以有效地应用于一步法RTPCR，原因如下：1.大部分的逆转录酶(逆转录过程的关键酶)不能作为热启动过程的靶点，原因在于它们不具有耐热性，会在高温孵育后丧失活性。2.待检的RNA分子是不稳定的，在高温下会降解。而二价金属离子如Mg2+的存在会大大促进RNA分子的降解。目前没有一种已有的热启动技术可以在不损害靶点RNA分子的前提下进行。3.逆转录过程的长时间孵育(一般在30分钟或更长)会极大地提高副反应发生的几率，因此将会导致检测灵敏度的明显降低。这表明基于酶抑制剂的热启动技术不能改善一步法RTPCR的效果。鉴于核酸扩增的现实重要性，核酸检测领域急需一种可以改善核酸扩增反应特别是一步法RTPCR的效果的新技术。本申请中将会详细描述一种新型核酸扩增反应的可控启动。在本说明书全文中提及的所有专利，专利申请以及出版物均以援引的方式纳入本文。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人发现，目前还没有一种涉及寡聚核苷酸的热启动技术，作为核酸扩增的必需成分，寡聚核苷酸是热启动或可控启动技术的理想耙位。本专利技术提供了一种靶核酸序列或信号的扩增方法，其中所用的扩增反应混合物含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸，该非羟基3’端可在一种化学物质和/或辐射和/或一定温度范围作用下转化为羟基3’端。本专利技术还提供了一种靶核酸序列或信号的扩增方法，包括下述步骤：(a)把一个怀疑含有靶核酸的样本与扩增反应混合物相接触，该反应混合物含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸，该非羟基3’端可在一种化学物质和/或辐射和/或一定温度范围作用下转化为羟基3’端；(b)将步骤(a)中混合物与所述的化学物质相接触和/或暴露于辐射和/或置于一定温度范围下，充分作用一段时间以再生羟基3’端；和(c)进行扩增反应。本专利技术还提供一种可以扩增靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括如下步骤：(a)将一个怀疑含有靶核糖核酸的样本与扩增反应混合物相接触，该反应混合物至少含有一个具有非羟基-3’端的一种第一可逆修饰寡核苷酸，该非羟基3’端可在一种第一化学物质和/或第一种辐射和/或一个第一温度范围作用下转化为羟基3’端；(b)在核糖核酸的逆转录条件下，孵育步骤(a)中混合物；(c)将步骤(b)中混合物与所述第一化学物质相接触和/或暴露于第一种辐射和/或置于所述第一温度范围下，充分作用以使得所述第一可逆修饰的寡核苷酸的3’端再生为羟基；(d)进行扩增反应，产生引物延伸产物。在上述靶核糖核酸序列扩增方法的一个实施方案中，扩增反应混合物还含有至少一种第二可逆修饰寡核苷酸，其中所述第二可逆修饰寡核苷酸具有非羟基3’端，且该非羟基3’端可以在一种第二化学物质和/或辐射和/或一个第二温度范围作用下转化为羟基3’端；其中所述方法还包括下述步骤：在步骤(b)之前，将步骤(a)中的混合物与所述第二化学物质相接触和/或暴露于辐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增靶核酸序列或信号的方法，该方法中所用的扩增反应混合物中含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸；该非羟基3’端可以在一种化学物质和一定温度范围作用下转化为羟基3’端，其中所述温度范围为高于60℃。

【技术特征摘要】
2006.07.31 US 60/834,4101.一种扩增靶核酸序列或信号的方法，该方法中所用的扩增反应混合物中含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸；该非羟基3’端可以在一种化学物质和一定温度范围作用下转化为羟基3’端，其中所述温度范围为高于60℃。2.权利要求1所述的方法，包括以下步骤：(a)将一个怀疑含有靶核苷酸的样本与扩增反应混合物相接触，该反应混合物含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸，该非羟基3’端可在一种化学物质和一定温度范围作用下转化为羟基3’端，其中所述温度范围为高于60℃；(b)将步骤(a)中混合物与所述的化学物质相接触和置于一定温度范围下，充分作用一段时间以再生羟基3’端；和(c)进行扩增反应。3.权利要求1所述的方法，其中所述核酸为核糖核酸，所述方法包括如下步骤：(a)将一个怀疑含有靶核糖核酸的样本与扩增反应混合物相接触，该反应混合物含有至少一种具有非羟基3’端的一种第一可逆修饰寡核苷酸，该非羟基3’端可在一种第一化学物质和一个第一温度范围下转化为羟基3’端，其中所述第一温度范围为高于60℃；(b)在核糖核酸的逆转录条件下，孵育步骤(a)中混合物；(c)将步骤(b)中混合物与所述第一化学物质相接触和置于所述第一温度范围下，充分作用以使得所述第一可逆修饰的寡核苷酸的3’端再生为羟基；(d)进行扩增反应，产生引物延伸产物。4.权利要求3所述的方法，其中所述扩增反应混合物含有至少一种第二可逆修饰寡核苷酸，其中所述第二可逆性修饰寡核苷酸具有非羟基团3’端，且该非羟基3’端可以在一种第二化学物质和一个第二温度范围作用下被转化成羟基3’端，其中所述第二温度范围为高于60℃；该方法还包括下述步骤，在步骤(b)之前，将步骤(a)的混合物与所述第二化学物质相接触和置于所述第二温度范围下，充分作用以使得所述第二可逆修饰寡核苷酸的3’端再生为羟基。5.权利要求3所述方法，所述方法为一种两酶体系的一步法RT-PCR过程，其中至少使用了一种逆转录酶和一种耐热DNA聚合酶，或者所述方法为一种单酶体系的一步法RT-PCR的过程，其中只使用了一种兼有逆转录酶和DNA聚合酶双重功能的酶。6.权利要求2-5任一项所述的方法，其中所述非羟基3’端有至少25％、优选至少50％、更优选至少75％和最优选90％被转化成羟基3’端。7.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述可逆修饰寡核苷酸在其3’端具有一个羧酸酯基。8.权利要求7所述的方法，其羧酸酯基选自：甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、卤代乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、马来酸酯及其衍生物、琥珀酸酯及其衍生物、4-氧代戊酸酯、新戊酸酯、丁烯酸酯、...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕万里，
申请(专利权)人：毕万里，
类型：发明
国别省市：美国;US