【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利申请要求以2007年7月31日提交的美国专利No.60/834,41作为优先权基础。
本专利技术主要涉及核酸化学领域,更具体而言,本专利技术涉及扩增核酸序列或信号的方法和减少非特异性扩增的方法。
技术介绍
核酸扩增技术已被广泛应用于临床微生物学、血液检测、食品安全、遗传病的诊断与预后、环境微生物学、药物靶点发现和鉴定、法医学以及其他生物医学方面的研究。其中核酸扩增的简易高效性、特异性、灵敏度、准确度、精确度,以及经济可承受性至关重要。核酸序列特异性扩增可以对特定序列进行灵敏的检测。聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)是两种热循环扩增技术。相比PCR和LCR,等温扩增技术是一种在基本不变的温度下进行的扩增方法。转录介导扩增(Transcription-mediated amplification,TMA)、基于核酸序列扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、链置换扩增(strand-displacement amplifeation,SDA)、滚环扩增(rollingcircle amplification,RCA)、单引物等温扩增(single primer isothermalamplificatio,SPIATM)、指数单引物等温扩增(exponential single primerisothermal amplificati ...
【技术保护点】
一种扩增靶核酸序列或信号的方法,该方法中所用的扩增反应混合物中含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸;该非羟基3’端可以在一种化学物质和/或辐射和/或温度范围作用下转化为羟基3’端。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-7-31 60/834,4101.一种扩增靶核酸序列或信号的方法,该方法中所用的扩增反应混合物
中含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸;该非羟基3’
端可以在一种化学物质和/或辐射和/或温度范围作用下转化为羟基
3’端。
2.权利要求1所述的方法,包括以下步骤:
(a)将一个怀疑含有靶核苷酸的样本与扩增反应混合物相接触,该
反应混合物含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷
酸,该非羟基3’端可在一种化学物质和/或辐射和/或一定温度
范围作用下转化为羟基3’端;
(b)将步骤(a)中混合物与所述的化学物质相接触和/或暴露于辐射
和/或置于一定温度范围下,充分作用一段时间以再生羟基3’
端;和
(c)进行扩增反应。
3.权利要求1所述的方法,其中所述核酸为核糖核酸,所述方法包括如
下步骤:
(a)将一个怀疑含有靶核糖核酸的样本与扩增反应混合物相接触,
该反应混合物含有至少一种具有非羟基3’端的一种第一可逆修
饰寡核苷酸,该非羟基3’端可在一种第一化学物质和/或辐射和
/或一个第一温度范围下转化为羟基3’端;
(b)在核糖核酸的逆转录条件下,孵育步骤(a)中混合物;
(c)将步骤(b)中混合物与所述第一化学物质相接触和/或暴露于辐
射和/或置于所述第一温度范围下,充分作用以使得所述第一可
逆修饰的寡核苷酸的3’端再生为羟基;
(d)进行扩增反应,产生引物延伸产物。
4.权利要求3所述的方法,其中所述扩增反应混合物含有至少一种第二
可逆修饰寡核苷酸,其中所述第二可逆性修饰寡核苷酸具有非羟基团
3’端,且该非羟基3’端可以在一种第二化学物质和/或辐射和/或一
个第二温度范围作用下被转化成羟基3’端;该方法还包括下述步骤,
在步骤(b)之前,将步骤(a)的混合物与所述第二化学物质相接触和/
或暴露于辐射和/或置于所述第二温度范围下,充分作用以使得所述
第二可逆修饰寡核苷酸的3’端再生为羟基。
5.权利要求3所述方法,所述方法为一种两酶体系的一步法RT-PCR过
程,其中至少使用了一种逆转录酶和一种耐热DNA聚合酶,或者所述
方法为一种单酶体系的一步法RT-PCR的过程,其中只使用了一种兼
有逆转录酶和DNA聚合酶双重功能的酶。
6.权利要求2-5任一项所述的方法,其中所述非羟基3’端有至少25%、
优选至少50%、更优选至少75%和最优选90%被转化成羟基3’端。
7.权利要求1-5任一项所述的方法,其中所述可逆修饰寡核苷酸在其3’
端具有一个羧酸酯基。
8.权利要求7所述的方法,其羧酸酯基选自:甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、
卤代乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、
马来酸酯及其衍生物、琥珀酸酯及其衍生物、4-氧代戊酸酯、新戊
酸酯、丁烯酸酯、4-甲氧基丁烯酸酯和3-苯丙酸酯等。
9.权利要求7所述的方法,其中用于再生3’羟基的化学物质选自:叠
氮化物、咪唑、吡啶、羟胺、肼和四丁基氢氧化铵。
10.权利要求7所述的方法,在再生3’羟基时,一种化学物质和在一定
温度范围内孵育同时作用。
11.权利要求7所述的方法,其中所述羧酸酯是马来酸脂,并且使用羟胺
或肼来再生3’羟基。
12.权利要求7所述的方法,其中所述羧酸酯是马来酸脂,并且使用羟胺
或肼来再生3’羟基,并同时在一定温度范围内孵育。
13.权利要求1-5任一项所述的...
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